[發(fā)明專利]在載體上固定化核酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980138951.2
• 申請日: 2009-09-22
• 公開（公告）號: CN102171368A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A.皮里克;H.R.斯塔珀特
• 申請（專利權(quán)）人: 皇家飛利浦電子股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;劉鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在載體上固定化核酸的方法，其包括提供帶有僅一種堿基類型的核苷酸段的核酸以及通過光交聯(lián)在載體上固定化所述核酸，其中所述光交聯(lián)在波長約300-500nm，優(yōu)選在波長365nm進(jìn)行。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明固定化的核酸的分析方法，其包括固定化核酸與包含互補(bǔ)片段的探針、包含單錯(cuò)配片段的探針、包含雙錯(cuò)配片段的探針和/或包含攜帶更高數(shù)量錯(cuò)配片段的探針雜交，以及隨后確定由固定化核酸和雜交探針形成的雜合體（hybrid）的解鏈點(diǎn)。

另外，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法獲得的固定化核酸，相應(yīng)的固定化核酸用于生產(chǎn)核酸陣列和診斷試劑盒的應(yīng)用，所述診斷試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明固定化的核酸陣列。

背景技術(shù)

在現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中，生物芯片或生物學(xué)微陣列，特別是DNA微陣列，?已經(jīng)成為重要的工具。通常地，芯片由大量的核酸分子構(gòu)成的顯微點(diǎn)排列組成，每一個(gè)顯微點(diǎn)包含小量的特異的核酸序列。這個(gè)可以是，例如，基因或其他DNA元件的短片段，在允許捕獲探針和相應(yīng)的靶標(biāo)結(jié)合的情況下，該短片段被用于作為捕獲探針以雜交cDNA?或?cRNA樣品（靶標(biāo)或靶探針）。捕獲探針-靶標(biāo)雜交通常通過熒光團(tuán)標(biāo)記靶標(biāo)的基于熒光的檢測來檢測和定量，以確定核酸序列在靶標(biāo)中的相對豐度。

微陣列技術(shù)由DNA印跡進(jìn)化而來，在其中片段DNA附著在基片（substrate）上，然后用已知的基因或片段探測。1987年，首次描述了陣列上的獨(dú)特DNA的集合用于表達(dá)譜，陣列DNA用于識別表達(dá)受到干擾素調(diào)節(jié)的基因。這些早期的基因陣列利用針點(diǎn)樣裝置，通過將cDNA點(diǎn)樣到濾紙上來制作。小型化微陣列的應(yīng)用，特別是在基因表達(dá)譜上的應(yīng)用，在1990年首次被報(bào)道。在微陣列上的完整的真核基因組在1997年公布。

多種技術(shù)可以被用于制作這樣的微陣列。這些技術(shù)包括用精細(xì)尖端的針點(diǎn)樣(printing)，使用預(yù)制掩膜的光刻法，使用動態(tài)微鏡裝置的光刻法，噴墨點(diǎn)樣(Lausted?C等人，2004,?Genome?Biology?5:?R58)或者電化學(xué)。

光刻技術(shù)通過直接在陣列表面合成序列，訴諸寡核苷酸陣列的生產(chǎn)。這種技術(shù)包括在硅基片上光刻合成，在基片上光和光敏掩膜劑被用于產(chǎn)生一條序列，每次通過全部陣列加一個(gè)核苷酸(Pease等人，1994,?PNAS?91:?5022–5026)。每一條可用的探針在將陣列浸入單獨(dú)一種核苷酸的溶液中之前選擇性地去除掩膜，然后掩膜反應(yīng)發(fā)生，下一套探針去除掩膜，為不同的核苷酸暴露做準(zhǔn)備。幾次重復(fù)之后，每條探針的序列完全構(gòu)建。因此，構(gòu)建的寡核苷酸可以較長（例如60-mers）或較短（例如25-mers），依賴于預(yù)期的目的。

在點(diǎn)樣的微陣列中，寡核苷酸探針作為完整的序列被沉淀，即探針在沉淀到陣列表面前被合成，然后點(diǎn)樣到基片上。通常的方法使用由機(jī)械臂控制的精細(xì)的針或針頭構(gòu)成的陣列，將其浸入含有DNA探針的孔中，然后在陣列表面上設(shè)定的位置沉淀每條探針，或者用噴墨點(diǎn)樣裝置，通過液滴噴射沉淀探針材料。產(chǎn)生的探針陣列代表了制備的捕獲探針的核酸譜，并且可以與例如源自實(shí)驗(yàn)室和臨床樣品的互補(bǔ)的cDNA和cRNA靶探針相互作用。另外，這些陣列可以容易地為特別試驗(yàn)定制，因?yàn)樘结樅驮陉嚵猩系狞c(diǎn)樣位置可以被特異地選擇。

這些技術(shù)中的一些的關(guān)鍵是在載體或材料上有效地固定化核酸。在載體上固定化核酸的經(jīng)典的方法是運(yùn)用紫外光，即紫外交聯(lián)。Church和Gilbert在1984年描述了運(yùn)用波長為254nm的紫外光導(dǎo)致DNA片段固定化到尼龍濾膜上（Church和Gilbert，?PNAS，?1984，?81，?p:?1991-1995）。這種方法的高級版本是由Saiki?等人.,?PNAS,?1989,?86,?p:?6230-6234提出的，其描述了當(dāng)使用波長為254nm的紫外光時(shí)包含多聚脫氧胸腺嘧啶（poly(dT)）尾的寡核苷酸可以更容易地被固定到膜上。此效果歸結(jié)于光激活的胸腺嘧啶堿基更有效的結(jié)合到膜上。

但是，用254nm附近的短波長紫外光照射核酸通常引起核酸分子嚴(yán)重的損傷，其可影響分子與互補(bǔ)序列雜交的能力并可因此危害它們在微陣列系統(tǒng)中的應(yīng)用。特別是這樣的照射可引起嘧啶二聚體的產(chǎn)生，由于在相鄰的嘧啶之間建立了環(huán)丁環(huán)，特別是在相鄰的胸腺嘧啶殘基之間。進(jìn)一步的影響可以是產(chǎn)生相鄰的胸腺嘧啶和胞嘧啶殘基間的聯(lián)合，導(dǎo)致TC（6,4）產(chǎn)物。

因此，存在對一種替代的核酸固定化方法的需求，其允許在載體上有效地固定核酸并克服伴隨著在254nm周圍的傳統(tǒng)紫外交聯(lián)帶來的對分子不利的損傷。

發(fā)明內(nèi)容