[發(fā)明專利]木質素所致失活降低的第6家族纖維素酶

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980137069.6
• 申請日: 2009-07-30
• 公開（公告）號: CN102159707A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 詹姆斯·拉維涅;布賴恩·斯克特;馬丁內·惠塞爾;約翰·托馬舍克
• 申請（專利權）人: 艾歐基能源公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12P19/00;C12P21/02;C12S3/04;C12N15/56;C12N15/80
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;田旸

技術領域

本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的第6家族纖維素酶(Family?6?cellulase)。更具體地說，本發(fā)明涉及木質素所致失活降低的經(jīng)修飾的里氏木霉(Trichoderma?reesei)第6家族(TrCel6A)纖維素酶。本發(fā)明還涉及基因構建物，其包含編碼經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶的核苷酸序列，還涉及從宿主菌株中生產(chǎn)經(jīng)修飾纖維素酶的方法和經(jīng)修飾TrCel6A纖維素酶在木質纖維素底物水解中的用途。

背景技術

地球上超過一半的有機碳被發(fā)現(xiàn)存在于植物的細胞壁中。植物細胞壁包括三種主要的化合物：纖維素、半纖維素和木質素。這些化合物被統(tǒng)稱為“木質纖維素”，它們代表了用于發(fā)酵制備乙醇或其它高值產(chǎn)品的糖和其它有機分子的潛在來源。

由于纖維素乙醇的環(huán)境友好性和可持續(xù)性，木質纖維素生物質向乙醇的轉化已成為新能源政策的關鍵特征。目前正在開發(fā)若干技術用于纖維素的轉化。值得關注的有以下方法，通過將木質纖維素生物質預處理，而提高其對水解酶的敏感性，而后酶促水解成糖，這些糖再被發(fā)酵成乙醇或其它高值有機分子(例如丁醇)。常見的預處理方法包括稀酸蒸汽爆破(Dilute?acid?steam?explosion，美國專利編號4,461,648)、氨冷凍爆破(Ammonia?freeze?explosion，AFEX；Holtzapple?et?al.，1991)和有機溶劑萃取(Organosolv?extraction，美國專利編號4,409,032)。水解和發(fā)酵系統(tǒng)可以是獨立的(依次水解和發(fā)酵(Sequential?hydrolysis?and?fermentation，SHF))，也可以是同時發(fā)生的(同時糖化和發(fā)酵(Simultaneous?saccharification?and?fermentation，SSF))。在所有情況下，半纖維素和纖維素被分解成可發(fā)酵糖，同時木質素被分離出來并且可以用作固體燃料或作為其它有機分子的來源。

對于將經(jīng)預處理的木質纖維素生物質轉化成糖的酶的選擇在很大程度上取決于預處理的方法。稀酸蒸汽爆破引起了半纖維素的顯著化學水解，因此使得用于將半纖維素轉化為糖類的酶與此過程關系不大。相比之下，AFEX和有機溶劑萃取都保留了半纖維素和纖維素的大致完整性。與稀酸蒸汽爆破或AFEX不同，有機溶劑萃取從底物中去除了相當一部分的木質素。在所有情況下，酶促水解的主要目標是纖維素，使用纖維素酶的組合將其轉化為糖類。

纖維素酶有兩種基本類型：內切葡聚糖酶，其切割纖維素鏈中間的糖苷鍵，并且這樣做時，產(chǎn)生了新的鏈末端；纖維二糖水解酶，其從纖維素鏈的末端切下短的寡糖。葡萄糖苷酶將短的寡糖消化成單糖。因此，這三種酶組分協(xié)同作用產(chǎn)生高效的纖維素水解酶系統(tǒng)。大多數(shù)纖維素酶具有相似的模塊結構，其由催化結構域、連接肽和糖結合模塊(Carbohydrate-binding?module，CBM)組成。

經(jīng)修飾的纖維素酶和修飾的方法已有廣泛描述。例如，已有報道改善熱穩(wěn)定性的里氏木霉Cel7A和Cel6A的變體(美國專利編號7,375,197；WO?2005/028636，美國專利公開編號2007/0173431；美國專利公開編號2008/167214，WO?2006/074005；美國專利公開編號2006/0205042；美國專利編號7,348,168；WO?2008/025164)。特別是，在里氏木霉Cel6A的第413位使用脯氨酸替代絲氨酸，或在其它的第6家族纖維素酶中使用脯氨酸替代等同于第413位上的氨基酸以賦予增強的熱穩(wěn)定性(WO2008/025164)。已有顯示，在里氏木霉Cel6A和其它第6家族纖維素酶的催化結構域中在等同于103、136、186、365和410位的位置上的突變引起葡萄糖所致抑制作用的降低(美國專利公開編號2009/0186381)。已創(chuàng)造出對用于去污劑制劑的蛋白酶和表面活性劑具有抗性的變體，以用于紡織應用(WO99/01544，WO?94/07998和美國專利號碼6,114,296)。