[發明專利]木質素所致失活降低的第6家族纖維素酶

無效

• 申請號: 200980137069.6
• 申請日: 2009-07-30
• 公開（公告）號: CN102159707A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 詹姆斯·拉維涅;布賴恩·斯克特;馬丁內·惠塞爾;約翰·托馬舍克
• 申請（專利權）人: 艾歐基能源公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12P19/00;C12P21/02;C12S3/04;C12N15/56;C12N15/80
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;田旸

1.經修飾的里氏木霉(Trichoderma?reesei)第6家族(TrCel6A)纖維素酶，其包含一個或多個選自下列的氨基酸替換：

用中性或酸性氨基酸替換129和410位中一個或多個位置的堿性氨基酸；

用酸性氨基酸替換322和363位中一個或多個位置的中性氨基酸；和

用蘇氨酸替換186位的氨基酸；

其中，所述經修飾TrCel6A的83-447位氨基酸與SEQ?ID?NO：1的83-447位氨基酸具有約47％至約99.9％的同一性。

2.權利要求1的經修飾TrCel6A纖維素酶，其中所述經修飾TrCel6A纖維素酶的83-447位氨基酸與SEQ?ID?NO：1的83-447位氨基酸具有約70％至約99.9％的同一性，并且其中與親本TrCel6A纖維素酶相比，所述經修飾TrCel6A纖維素酶顯示出木質素所致失活程度減少至少15％。

3.權利要求2的經修飾TrCel6A纖維素酶，其中所述經修飾TrCel6A纖維素酶的83-447位氨基酸與SEQ?ID?NO：1的83-447位氨基酸具有約90％至約99.9％的同一性。

4.權利要求1至3任何一項的經修飾TrCel6A纖維素酶，其中所述氨基酸替換選自：K129E、S186T、A322D、Q363E、R410G和R410Q。

5.權利要求1至4任何一項的經修飾TrCel6A纖維素酶，其還包含選自下列的一個或多個氨基酸替換：Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I和S413P。

6.分離的基因構建物，其包含編碼權利要求1至5任何一項所述經修飾TrCel6A纖維素酶的核酸序列。

7.分離的遺傳修飾微生物，其含有權利要求6的基因構建物。

8.權利要求7的分離的遺傳修飾微生物，其中所述微生物是酵母或絲狀真菌的物種。

9.權利要求8的分離的遺傳修飾微生物，其中所述微生物是釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)或里氏木霉(Trichoderma?reesei)。

10.生產經修飾TrCel6A纖維素酶的方法，其包括下列步驟：在誘導經修飾TrCel6A纖維素酶表達和分泌的條件下，在培養基中培養權利要求7的遺傳修飾微生物，以及從所述培養基中回收經修飾TrCel6A纖維素酶。

11.水解纖維素底物的方法，其包括在木質素存在下將底物與權利要求1至5任何一項的經修飾TrCel6A纖維素酶相接觸。

12.權利要求11的方法，其中所述纖維素底物是經預處理的木質纖維素原料，其中酶促水解產生可發酵的糖。

13.權利要求12的方法，其中所述經預處理的木質纖維素原料選自：玉米秸稈、小麥秸稈、大麥秸稈、稻秸稈、燕麥秸稈、油菜秸稈、大豆秸稈、玉米纖維、甜菜漿、紙漿廠細屑和廢渣、甘蔗渣、硬木、軟木、木屑、柳枝稷、芒草、網茅草和草蘆。

14.生產經修飾TrCel6A纖維素酶的方法，其包括以下步驟：(i)用權利要求6定義的基因構建物轉化真菌宿主細胞以產生重組真菌菌株；(ii)選擇表達經修飾TrCel6A纖維素酶的重組真菌菌株；以及(iii)在誘導經修飾TrCel6A纖維素酶表達的條件下在深層液體發酵中來培養步驟(ii)中選擇的重組真菌菌株。

15.經修飾的第6家族糖苷酶，其選自下列：

TrCel6A-K129E-S413P(SEQ?ID?NO：37)；

TrCel6A-S186T-S413P(SEQ?ID?NO：38)；

TrCel6A-A322D-S413P(SEQ?ID?NO：39)；

TrCel6A-Q363E-S413P(SEQ?ID?NO：40)；

TrCel6A-R410G-S413P(SEQ?ID?NO：41)；

TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ?ID?NO：42)；

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P(SEQ?ID?NO：43)；和

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P(SEQ?ID?NO：44)。