[發(fā)明專利]具有提高的活性的β-葡糖苷酶變體及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980136701.5
• 申請日: 2009-09-10
• 公開（公告）號: CN102149819A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尼古拉斯·洛普·費雷拉;安東尼·馬爾若;于格·馬蒂;洛朗·富拉熱
• 申請（專利權(quán)）人: IFP新能源公司;普羅托斯公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N9/24;C12N15/81
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 陳文平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶的表達(dá)和優(yōu)化。更具體地，本發(fā)明涉及包含至少一個氨基酸修飾的β-葡糖苷酶變體，這些修飾的氨基酸根據(jù)里氏木霉菌β-葡糖苷酶的SEQ?ID?No.2的編號位于第225、238、240和241位。本發(fā)明還涉及這些具有改善的效能的變體在纖維素分解方法和生物燃料(例如：乙醇、丁醇、異丙醇)的制備方法中的用途。

背景技術(shù)

乙醇是一種清潔燃料，并且起始原料來源廣泛，因此從纖維素制備乙醇的可能性已經(jīng)得到了極大的關(guān)注。

該方法的天然纖維素起始原料用術(shù)語“生物質(zhì)”表示。許多類型的生物質(zhì)，包括木材、農(nóng)業(yè)廢棄物、草本作物和固體廢物，被認(rèn)為可以用作制備生物燃料的起始原料。這些原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)纖維素組成。

纖維素是由葡萄糖分子組成的聚合物，其中葡萄糖分子通過β1-4鍵連接，該連接對于酸、酶或微生物的分解或解聚作用具有很強(qiáng)的抗性。一旦纖維素轉(zhuǎn)變成葡萄糖，所述葡萄糖就易于通過酵母發(fā)酵形成生物燃料，例如乙醇。

這些將纖維素轉(zhuǎn)變成糖的傳統(tǒng)研究方法都是基于酸水解作用。這些方法可在濃酸或稀酸存在的情況下進(jìn)行。但是，這些方法存在一些缺點，例如在使用濃酸時，酸的回收率差，在使用稀酸時，葡萄糖產(chǎn)率低，這些都使酸水解方法不能實現(xiàn)商業(yè)化。

為了克服酸水解方法的缺點，最近提出了使用纖維素型酶進(jìn)行酶水解的纖維素轉(zhuǎn)化方法。但是酶水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)(例如纖維素)的方法也有工業(yè)生產(chǎn)成本過高的缺點。因此，有必要使用分泌更加有效的纖維素酶的微生物株。

在此方面，許多微生物含有水解纖維素的酶，例如真菌：木霉菌(Trichoderma)、曲霉菌(Aspergillus)、腐質(zhì)霉菌(Humicola)或鐮孢菌(Fusarium)，以及細(xì)菌，例如：熱單孢菌(Thermomonospora)、芽孢桿菌(Bacillus)、纖維單胞菌(Cellulomonas)和鏈霉菌(Streptomyce)。這些微生物中的酶在用于將纖維素轉(zhuǎn)變成葡萄糖時具有三種活性類型，因此可被分成三組：內(nèi)切葡聚糖酶，隨機(jī)地作用于纖維素纖維的內(nèi)部；外切葡聚糖酶，作用于纖維素的末端，釋放出纖維二糖；β-葡糖苷酶，將此纖維二糖水解成葡萄糖。這些β-葡糖苷酶是纖維素轉(zhuǎn)化方法的限速步驟。這是因為該方法的主要困難在于纖維二糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，因為在制備生物燃料時，在方法結(jié)束時任何未水解的纖維二糖代表收率的損失。

由于一些產(chǎn)生纖維素酶的微生物，包括木霉菌，產(chǎn)生的β-葡糖苷酶極少，因此在酶水解方法中纖維二糖的蓄積是一個主要的問題。具體而言，工業(yè)木霉菌株產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)中，β-葡糖苷酶類型要少于1％。因此，較低的β-葡糖苷酶量導(dǎo)致將纖維二糖水解成葡萄糖的容量較低，從而導(dǎo)致了所述纖維二糖在系統(tǒng)中的蓄積。而且，高濃度的纖維二糖抑制了其它以纖維二糖作為最終反應(yīng)產(chǎn)物的纖維素酶，特別是外切葡聚糖酶的活性。

已經(jīng)提出了幾種提高微生物中的β-葡糖苷酶活性，從而提高纖維二糖到葡萄糖的轉(zhuǎn)化率的方法。

第一種方法包括加入外源性產(chǎn)生的β-葡糖苷酶到微生物分泌的混合物中，以促進(jìn)水解。然而，該方法由于成本昂貴而沒有商業(yè)可行性。

第二種方法，如WO?92/010581中描述，采用基因工程方法將新的β-葡糖苷酶基因的拷貝插入到微生物的基因組中，如此所述微生物產(chǎn)生大量的酶。

第三種方法，如WO?99/46362中描述，包括使用包含啟動子、成熟的β-葡糖苷酶基因和木聚糖酶分泌信號序列的基因構(gòu)建物對微生物進(jìn)行遺傳修飾。木聚糖酶分泌信號序列的存在使得可能顯著提高微生物產(chǎn)生的β-葡糖苷酶的量。

然而，為了使木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水解有效和有經(jīng)濟(jì)價值，該酶混合物必須由一種并且是唯一的菌株產(chǎn)生，并且必須包括平衡比例的各種酶活性(尤其是，但不僅僅是，外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡糖苷酶)。舉例來說，在里氏木霉菌的天然混合物中，一般存在70-80％的外切葡聚糖酶、15-20％的內(nèi)切葡聚糖酶、數(shù)個百分比的半纖維素酶和約0.5％的β-葡糖苷酶。該混合物完全適合水解大多數(shù)的預(yù)處理的底物(例如，在酸性條件下蒸汽爆破(steam-explode)處理的麥稈)，并且收率可以接受。總之，如果通過富集酶的量以增加β-葡糖苷酶的活性，其必須不能損害其它酶的活性。

因此，不顯著改變混合物中所有酶的比例而獲得高β-葡糖苷酶活性的可能性，對于將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)變成生物燃料的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容