[發明專利]變異型酶的設計法、制備方法和變異型酶

有效

• 申請號: 200980134865.4
• 申請日: 2009-08-12
• 公開（公告）號: CN102597232A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 橋爪亮太;三上文三;松原寬敬;松永亞希子;山口莊太郎
• 申請（專利權）人: 天野酶株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N9/00;C12P21/02
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 苗堃;金世煜

技術領域

本發明涉及對蛋白質進行脫酰胺化的變異型酶的設計法、制備方法和變異型酶等。?

背景技術

蛋白質脫酰胺酶是水解蛋白質中的谷氨酰胺、天冬酰胺的酰胺基，轉變為谷氨酸、天冬氨酸，而游離氨的酶。蛋白質脫酰胺酶可以適用于提高蛋白質的功能性(溶解性、乳化特性、泡沫特性、凝膠化特性等)、提高小麥麩質的生面團(ドウ)的伸展性、降低小麥變應原誘發性、提高從農產物中提取蛋白質的提取效率、提高蛋白質溶液中的鈣溶解性等各種用途，是一種產業上利用性很高的酶。

蛋白質脫酰胺酶廣泛存在自然界中。作為最為熟知的例子，可以列舉微生物來源的蛋白質谷氨酰胺酶(專利文獻1、2)。據報道，植物中，發芽中的小麥、菜豆、南瓜的種子中存在將蛋白質中的谷氨酰胺殘基脫酰胺的酶(非專利文獻1)。而且，已知的是生物體內也含有，而且在自然界中也廣泛存在，例如，近年來作為食品加工用酶被廣泛使用的放線菌來源的谷氨酰胺轉移酶催化蛋白質中的谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基之間的交聯反應，在反應系中不存在賴氨酸等伯胺時，對蛋白質中的谷氨酰胺殘基進行脫酰胺化(非專利文獻2)。而且，據報道，在其它微生物中，細菌(Bacillus?circulans)的菌體內存在對肽中的谷氨酰胺殘基進行脫酰胺化的酶，即肽谷氨酰胺酶(非專利文獻3)。?

在利用蛋白質脫酰胺酶時，與其它酶一樣，根據用途調節底物和酶的濃度、反應溫度、反應時間等。可是，存在著只通過調節這種酶反應條件，無法制造出目的生成物的情況、無法獲得所期待的收量的情況，對蛋白質脫酰胺酶的性質本身進行改良的必要性就產生了。而且，作為產業用酶劑利用時，保存穩定性十分重要，然而，由于一般來說，酶對氧的穩定性低，因此為了維持充分的保存穩定性，需要添加穩定化劑或脫氣狀態下的包裝等，這關系到成本增加。?

為了改變蛋白質脫酰胺酶的性質，一般需要制備蛋白質脫酰胺酶的變異體，評價其活性、底物特異性等，鑒定優良的變異體，但這些工序需要很大的勞力。?

專利文獻?

專利文獻1：特開2000-50887號公報?

專利文獻2：特開2001-218590號公報?

專利文獻3：特開2004-97099號公報?

非專利文獻?

非專利文獻1：Vaintraub，I.A.，Kotova，L.V.&Shaha，R.(1996)Protein?deamidases?from?germinating?seeds.Physiol.Plantarum.96，662-666.?

非專利文獻2：「産業用酵素」(1995)上島孝之、丸善、3.2.6食品功能的改良「谷氨酰胺轉移酶的利用」pp.40-42?

非專利文獻3：Kikuchi，M.，Hayashida，H.，Nakano，E.&Sakaguchi?K.(1971)Peptidoglutaminase.Enzymes?for?selectivedeamidation?ofγ-amido?of?peptide-boundglutamine.Biochemistry?10，1222-1229.?

發明內容

本發明的目的之一是提供改良對蛋白質進行脫酰胺化的酶的新方法。此外，本發明的另外的目的是提供作用性和穩定性得到改良的變異型酶。作用性的變化可以使得酶使用量降低、使反應時間縮短、擴大用途等。另一方面，穩定性的改良可以提供保存穩定性高的酶劑。?