[發明專利]凝血酶底物和測定樣本中生物活性凝血酶水平的測定法

有效

• 申請號: 200980131917.2
• 申請日: 2009-07-10
• 公開（公告）號: CN102124346A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 秦秋平;哈里·塔卡洛;阿倫·M·伯納德;柯爾斯滕·M·雅各布森
• 申請（專利權）人: 雷迪奧米特醫學公司
• 主分類號: G01N33/86
• 分類號: G01N33/86;C07K5/08;C07K5/10
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張平元

本發明涉及新穎的凝血酶底物和測定樣本中生物活性凝血酶水平的測定法。

凝血酶由活化的因子X(Xa)酶切凝血酶原上的兩個位點產生。

凝血酶將纖維蛋白原轉化為活化形式，其組裝為纖維蛋白。凝血酶還激活因子XI、因子V和因子VIII。該正反饋加速凝血酶的產生。

因子XIII也可由凝血酶激活。因子XIIIa為轉谷氨酰胺酶，其催化纖維蛋白中的賴氨酸和谷氨酰胺殘基之間形成共價鍵。該共價鍵增加纖維蛋白凝塊的穩定性。

除了其在凝血級聯中的活性，凝血酶還經過激活血小板上蛋白酶活化的受體促進血小板的激活。

在臨床實踐中，凝血酶原時間(PT)的測量，即血液變為凝塊所花的時間，以活化部分凝血激酶時間(APTT)和活化凝血時間(ACT)的方式，廣泛用于篩選凝血途徑的缺陷以及監測抗凝血治療。

為了標準化凝血測試的結果，設計了國際標準化比率(INR)的概念。各組織因子(tissue?factor)的生產商為其生產的任何組織因子給出ISI(國際敏感指數，International?Sensitivity?Index)。所述ISI值指示特定批次的組織因子與國際標準化樣本之間的比較。INR為患者的凝血酶原時間與對照樣本的凝血酶原時間的比值，再運算所用促凝血酶原激酶試劑的ISI值的乘方。

INR＝(PT_測試/PT_標準)^ISI

對于PT的測量現有兩種可用的測定法。

一種測定法為凝血計量法(coagulometric)，其根據由纖維蛋白原至纖維蛋白轉化的凝塊形成的終點。然而，該測定的結果是可變的，并特別地受患者中纖維蛋白原/纖維蛋白轉化的干擾所影響。另一種測定為非凝血計量法(non-coagulometric)，其根據使用合成的、適合凝血酶裂解的底物。第二種測定的結果可變性較小并且不受纖維蛋白原水平的影響。

US?4,061,625公開了以下通式的發色凝血酶底物：

D-Phe-環狀亞氨基酸-Arg-pNA

其中環狀亞氨基酸選自2-氮雜環丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶羧酸，且pNA為p-硝基酰基苯胺(p-nitroanilide)。所述底物描述為適合定量測定凝血酶或適合其中凝血酶形成、抑制或消耗的反應的研究，或適合測定發揮影響的或參與該反應的因子，例如適合測定抗-凝血酶、凝血酶原和肝素。

當使用發色底物時，在大約405nm檢測反應。在該波長下不可分析全血，因為全血自身有吸收。因此當所用樣本類型為全血時發色底物不適用。

使用螯合物如鑭系元素螯合物的時間分辨發光光譜已經在免疫測定和DNA雜交測定中應用多年。由于全血的吸收性質，與發色底物相比，該螯合物檢測技術適用于當樣本為全血時，因為該技術可在615nm測量吸光度，而在該波長，全血吸收較低。

該螯合物描述在US?7,018,851?B1中，其公開了適合時間分辨熒光計(TRF)應用的改進的熒光鑭系元素螯合物。所述螯合物用于基于特異性生物親和性的結合測定，例如免疫測定。

TRF為非常適合要求高靈敏度和廣泛動力學范圍的測定的檢測技術。在使用常規熒光檢測的免疫測定技術中，由光散射導致的高強度非-特異性背景例如來自樣本的生物成分嚴重限制了測定的靈敏度。

所述熒光鑭系元素螯合物傳統上已經用于其中檢測原理為基于捕捉和檢測該螯合物的免疫測定中。相反，其尚未用于其中檢測原理為基于裂解螯合物底物和檢測測定中剩余的捕捉底物(未裂解的底物)的酶測定中。

該系統的主要特征為提供一方面穩定的、另一方面可特異性地被凝血酶裂解的底物。

因此，尚存在對酶底物的需求，其可特異性地被凝血酶裂解并包括具有長壽命的內在的穩定發光成分，因此便于檢測全血并產生較少干擾。

另外，尚存在對測定法的需求，其快速、簡便并容易進行，可變性低，容易自動化且成本低。

已經驚人地發現通過使用一些連接基將可特異性地被凝血酶裂解的肽與發光螯合物連接起來，提供了當樣本類型為全血時可以使用的具有長壽命的穩定的底物。

在第一方面中，本發明為具有以下通式的凝血酶底物：

A-X-Z-A’

其中

A或A’之一包括發光螯合物，以及

A或A’的另一個包括結合配對(binding?pair)的第一配偶體(partner)，任選包括間隔基，并經肽鍵連接至底物的剩余部分，