[發明專利]可維持從核苷酸模板酶促合成雙鏈核苷酸的非天然聚合酶底物及其使用的方法

無效

• 申請號: 200980125926.0
• 申請日: 2009-01-16
• 公開（公告）號: CN102124018A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: S·M·門琴;B·羅森布盧姆;P·肯尼;S·I·罕;馬兆春;J·陳;林英聯;黃波立
• 申請（專利權）人: 生命科技公司
• 主分類號: C07H19/073
• 分類號: C07H19/073;C07H21/04;C12Q1/68;C07H19/173
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 孔青;郭文潔

本申請要求2008年4月29號提交的臨時美國專利申請號61/048,808及2008年9月29號提交的臨時美國專利申請號61/136,732的權益。本申請通過引用上述每個申請引入他們的全部內容。

按照37C.F.R.§1.52(e)(5)的規定，創立于2009年1月16日、大小為7,129字節、名為68523_Seq_Listing.txt的序列表文本文件的全部內容通過引用引入本文。

本申請使用的各部分的標題僅用于組織用途，而不應解釋為以任何方式限制本申請描述的主題。

領域

本申請一般而言涉及聚合酶底物及使用所述底物來測定諸如DNA或RNA的核酸序列的方法。

引言

核酸測序通常包括克隆感興趣的核酸以便制備限定的核酸片段的大批樣品(bulk?samples)，隨后分析所述大批核酸。業已提出合成測序(sequencing?by?synthesis)作為達到快速從頭測序(de?novosequencing)的方法。合成測序可包括所擴增核酸單分子集合的分析或核酸單分子的分析；并且理論上可用來檢測天然基因組DNA，而無需細菌克隆或其它形式的擴增。

但是，仍然存在合成測序和單分子核酸測序改進方法的需求。

簡述

本申請提供以以下式(I)代表的化合物：其中：B是選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或他們各自的類似物的堿基；L₁是在堿基B和F間形成鍵的基團；F是在L₁和L₂間形成鍵的雜原子；L₂就它與F的鍵合而言是化學上不穩定基團，并且其與R₂形成化學鍵；L₃是H或是包含與R₂形成化學鍵的雜原子的化學上不穩定基團；每個R₂獨立地是包含報道分子的基團；R₁是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端摻入核苷三磷酸的模板定向聚合酶摻入反應(template?directed?polymerase?incorporation)速率的取代基(例如位于多磷酸末端的報道分子或猝滅劑)，這種抑制發生在L₂-R₂從先前摻入事件裂解之前。L₂-R₂防止向已摻入式(I)化合物的延伸中的寡核苷酸3’末端經模板定向聚合酶摻入反應摻入式(I)的化合物；l是整數，及m＝3l-1。

本申請也提供具有以下式(II)代表的結構的化合物：其中B、R₁、L₁、F、L₂、R₂、l和m與上文式(I)定義的一樣。

本申請也提供測定核酸序列的方法，該方法包括：(a)將引物與靶多核苷酸雜交以形成引物-靶雙鏈體，其中靶多核苷酸以其3’或5’末端連接于固相支持體；(b)將引物-靶雙鏈體與聚合酶以及一種或多種核苷酸類似物接觸以使核苷酸類似物摻入到引物的3’末端，從而形成延伸的引物鏈，其中所摻入的核苷酸類似物終止聚合酶反應，而其中所述一種或多種核苷酸類似物的每一種包含：(i)堿基，選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及他們的類似物；(ii)標記，其通過可裂解連接子(cleavable?linker)連接于所述堿基或其類似物；(iii)脫氧核糖；及(iv)一個或多個磷酸基；其中所述標記為所述堿基特有，以及其中所述多磷酸末端取代基、連接子和/或標記的組合抑制將另一核苷酸類似物摻入到延伸的引物鏈中的模板定向聚合酶摻入反應；(c)洗滌固相支持體表面以移除未摻入的核苷酸類似物；(d)檢測連接于剛摻入的核苷酸類似物的特有標記，藉此識別剛摻入的核苷酸類似物；(e)裂解在剛摻入的核苷酸類似物與所述特有標記之間的可裂解連接子，藉此允許另一核苷酸類似物摻入到延伸的引物鏈中；(f)洗滌固相支持體表面以移除裂解的化合物片段；及(e)重復步驟(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。

本申請的這些和其它特點在本文中有描述。

附圖簡述技術人員可理解以下描述的附圖僅用于說明目的。附圖并非意欲以任何方式限制本申請的范圍。本專利或申請文件包括至少一張彩色處理的圖。在要求及繳納必要費用時，專利局可提供這個帶有彩圖的專利文件或專利申請文件公開文本的副本。

圖1是描述在DNA合成測序期間二元報道分子系統(dual?reporter?system)連續釋放報道分子(reporter)的方法的簡圖。