[發明專利]蛋白質純化用分離劑和蛋白質純化方法

無效

• 申請號: 200980121965.3
• 申請日: 2009-06-22
• 公開（公告）號: CN102056937A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發明（設計）人: 益本誠二;小宮克夫;中村孝司
• 申請（專利權）人: 東曹株式會社
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;B01J20/22;B01J20/34;C07C211/53;G01N30/88
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

技術領域

本發明涉及具有特定配體的新型蛋白質純化用分離劑、及其制造方法以及使用該分離劑的蛋白質純化方法。

背景技術

為了能夠從水性混合物中分離和純化目標化合物，近年來，對多種技術進行了開發和/或優化。作為這種分離技術和/或純化技術，例如，已知有離子交換色譜法、疏水作用色譜法(HIC)(例如，參照非專利文獻1)、吸附色譜法等。這些色譜技術的多樣性一方面使分離和/或純化目標化合物的復雜程度最小化，另一方面反映了進行分離和/或純化的困難程度。并且，上述各種技術存在其在工業規模上的廣泛利用受到限制的多種缺陷。

例如，混合型色譜法用樹脂在以下領域中使用：該樹脂能夠在疏水性條件下與目標化合物結合，能夠在靜電性(離子性)或親水性條件下從該樹脂放出目標化合物(例如，參照非專利文獻2～5)。

現有的混合型色譜法用樹脂的典型問題之一在于，在目標化合物的溶液中，不使用高鹽濃度時，疏水性不太高的目標化合物對該樹脂的結合效率并不太高。

例如，在非專利文獻2中，預試驗級別的蛋白質對該樹脂的結合通過使用1M?NaCl溶液實現。需要在含有目標化合物的水性溶液中添加鹽的色譜技術，為了實現在工業規模下的收率而需要大量的試劑，需要相當多的工序。即，需要使用高濃度鹽的色譜法用樹脂并不是用于回收和/或純化工業量的這種目標化合物的、最有效且成本上效果較好的方法。

因此，在專利文獻1中，通過利用特定的離子性配體、并利用組合而成的混合型色譜法用樹脂上的高配體密度，能夠提供目標化合物在高離子強度和低離子強度下與樹脂結合的這種充分的疏水性性質，所述特定的離子性配體由1個離子性官能團和1個間隔物構成，該間隔物通過共價鍵將配體(Ligand)連結到樹脂的固體支撐基體上。另外，在專利文獻1中，通過使離子性官能團介導的樹脂上的電荷量增加，單純地改變放出溶液的pH值，從而利用親水性或靜電性(離子性)相互作用而能夠實現目標化合物從樹脂上放出。

然而，在專利文獻1記載的方法中，為了使間隔臂介于載體(固體支撐基體)與配體之間，其制造方法中需要經過許多非常復雜的工序，因而存在制造成本非常高的問題。

即，在專利文獻1記載的方法中，間隔臂是指通過共價鍵方式將離子性官能團連接到固體支撐基體上的原子團或取代體。作為這種間隔臂，可列舉出亞烴基、芳香族基團、烷基芳香族基團、酰胺基、氨基、脲基、氨基甲酸酯基、R₁和R₂分別為1個亞烴基(例如，C₁～C₆)且Y為氧或硫的-R₁-Y-R₂-基、以及與這些基團類似的基團。

并且，作為將上述間隔臂連接(鍵合)到載體上的方法，例如實施以下方法：使用羰基二咪唑(CDI)活化固體支撐基體，與氨基己酸反應，形成氨基甲酸酯中性鍵(參照專利文獻1)。

另外，作為將配體連接(鍵合)到上述間隔臂上的方法，例如實施以下方法：使用碳二亞胺(EDC)，使胺配體與氨基己酸樹脂發生偶聯反應，形成酰胺鍵(參照專利文獻1)。

這樣，在專利文獻1記載的方法中，在制造色譜法用樹脂時，需要經過繁雜的工序。另外，根據配體、間隔臂、和固體支撐基體的選擇，需要控制為最合適的pH值范圍，還存在工序更加繁雜化的問題。

另一方面，現有的蛋白質純化用的色譜法用填充劑，在吸附蛋白質時需要在緩沖液中添加大量的鹽，并在之后將鹽除去，因此需要消耗成本和勞力，從而期望開發出一種降低了鹽的量的、利用簡便的操作就能夠吸附蛋白質的填充劑。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特表平10-506987號公報

非專利文獻

非專利文獻1：Biochimie，Vol.60，1～15頁(1978)

非專利文獻2：J.Chromatogr.，Vol.510，149～154頁(1990)

非專利文獻3：J.Chromatogr.，Vol.296，329～337頁(1984)

非專利文獻4：Chem.Rev.，Vol.89，309～319頁(1989)

非專利文獻5：J.Chromatogr.，Vol.317，251～261頁(1984)

發明內容

發明要解決的問題