[發(fā)明專利]細(xì)胞法產(chǎn)生葡糖二酸

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980120747.8
• 申請日: 2009-04-03
• 公開（公告）號: CN102066552A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 文泰石;尹相活;克麗斯塔拉·拉內(nèi)特·瓊斯·普拉瑟
• 申請（專利權(quán)）人: 麻省理工學(xué)院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N1/11;C12N15/52;C12N15/63;C12P7/02;C07K16/00
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;韓宏星

關(guān)聯(lián)申請

根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請要求2008年4月4日提交的名稱為“微生物法產(chǎn)生葡糖二酸”的美國臨時申請NO.61/042,502的權(quán)益，其全文通過引用并入本文。

政府利益

本項(xiàng)工作得到海軍研究局基金N000140510656的部分資助。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過重組基因表達(dá)來產(chǎn)生葡糖醛酸和葡糖二酸。

背景技術(shù)

包括應(yīng)用重組DNA技術(shù)在內(nèi)的代謝工程，已經(jīng)顯示出其為以下多種目的而優(yōu)化細(xì)胞功能的潛力：重組蛋白的生產(chǎn)、提高生產(chǎn)力的途徑工程以及新產(chǎn)品產(chǎn)生的新途徑設(shè)計(jì)。新途徑被定義為在宿主物種中不存在的一系列轉(zhuǎn)化。已經(jīng)設(shè)計(jì)了新途徑并在大腸桿菌(E.coli)中構(gòu)建，用于生產(chǎn)1，3-丙二醇(C.E.Nakamura和G.M.Whited(2003).Curr.Opin.Biotechnol.14：454-459)、青蒿酸(Nature?Biotech，21，pp796-802)和1，2，4-丁三醇(JACS，125，pp12998-12999)。在這些方法中，每一個步驟均基于酶的可用性而設(shè)計(jì)，鑒定了來自不同生物體的所招募的酶的活性，并且通過組裝這些酶促步驟而在大腸桿菌中構(gòu)建新途徑。這些實(shí)例中的基本思想是將包括酶在內(nèi)的蛋白看作是可相互交換的部分，術(shù)語“合成生物學(xué)”已用于描述此概念(Nature?421，p118；Nature?Chemical?Biology，3，pp521-525)。

D-葡糖二酸可見于水果、蔬菜和哺乳動物中，并已經(jīng)針對其降低膽固醇(Z.Walaszek等(1996).Nutr.Res.16：673-681)和癌癥化療(J.Singh和K.P.Gupta(2003).Biomed?Environ.Sci.16：9-16)進(jìn)行了研究。在最近的一篇報(bào)道中(T.Werpy和G.Petersen(2004).“Top?Value?Added?Chemicals?From?Biomass，”Vol.I，PNNL?and?NREL)，D-葡糖二酸被確認(rèn)為“來自生物質(zhì)的高附加值化學(xué)品”以及用于產(chǎn)生新型尼龍和超支化聚酯的有希望的起始材料。D-葡糖二酸是含有4個手性碳的高度官能化化合物，目前通過利用硝酸作為氧化劑對D-葡萄糖進(jìn)行化學(xué)氧化而產(chǎn)生，該過程是非選擇性的并且昂貴(T.Werpy和G.Peterson(2004).“Top?Value?Added?Chemicals?From?Biomass，”Vol.I，PNNL?and?NREL)。利用酶的新型催化過程可帶來高產(chǎn)量和高選擇性。可以通過模仿哺乳動物體內(nèi)存在的D-葡糖二酸途徑而獲得產(chǎn)生葡糖二酸的生物學(xué)方法。但是，這種途徑效率不高，其包含超過10個以D-葡萄糖為起始原料的轉(zhuǎn)化步驟。

發(fā)明內(nèi)容

本文中描述了編碼糖醛酸脫氫酶之第一個udh基因的克隆和表征。本文中進(jìn)一步描述了通過將不同生物來源的“生物部分”相組合來建立細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)內(nèi)產(chǎn)生D-葡糖醛酸或D-葡糖二酸的新途徑。第一種酶即肌醇-1-磷酸合酶(Ino1/MIPS)，通過中間體葡萄糖-6-磷酸，由葡萄糖產(chǎn)生肌醇(Dean-Johnson和Henry，1989)。第二種酶即肌醇加氧酶(MIOX)，使肌醇轉(zhuǎn)化成葡糖醛酸。這兩種酶在細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)內(nèi)的共表達(dá)使得可以由葡萄糖產(chǎn)生葡糖醛酸。糖醛酸脫氫酶可以使葡糖醛酸轉(zhuǎn)化成葡糖二酸(Bateman和Kosuge等，1970；Wagner和Hollman，1976)。如本文所述，此第三種基因與INO1和MIOX同時表達(dá)使得可以由葡萄糖產(chǎn)生葡糖二酸。出乎意料的是，重組表達(dá)糖醛酸脫氫酶使該途徑的流量顯著增加，從而可以得到高產(chǎn)量的葡糖二酸。

本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)編碼糖醛酸脫氫酶之基因并且重組表達(dá)編碼肌醇加氧酶之基因的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，編碼糖醛酸脫氫酶的基因是細(xì)菌基因，例如丁香假單胞菌(Pseudomonas?syringae)基因或根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)基因。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇加氧酶的基因是哺乳動物基因，例如小鼠基因。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還重組表達(dá)編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因。在一些實(shí)施方案中，編碼肌醇-1-磷酸合酶的基因可以是真菌基因或酵母基因，例如釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)基因。