[發明專利]方法

無效

• 申請號: 200980119573.3
• 申請日: 2009-05-20
• 公開（公告）號: CN102037009A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發明（設計）人: R·塞維林森;C·克里斯托弗森
• 申請（專利權）人: 諾沃-諾迪斯克有限公司
• 主分類號: C07K14/685
• 分類號: C07K14/685;C07K1/107
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 劉辛;劉健

發明領域

本發明涉及在完全受保護的肽上進行環合以產生受保護的環肽的方法，由所述方法得到的產物及所述產物的用途。

發明背景

固相合成是眾所周知的生產肽的技術。固相肽合成(SPPS)中，氨基酸或肽基結合到固體載體樹脂上。然后，連續的氨基酸或肽基與該載體結合肽連接直到形成所需的肽材料。通常，所述載體結合肽接著從載體上裂解下來并進行進一步加工和/或純化。一些情況下，固相合成產生成熟肽產物；其它情況下，將從載體裂解下來的肽用于制備較大的成熟肽產物。

為了合成單一確定的肽序列，本領域技術人員通常采用Merrifield法來“生長”連接到固體載體的肽鏈。合成這些個別肽的方法已自動化。商業上可獲得的裝置可用于合成長度為一百或更多個氨基酸的肽。為了獲得任意長度的肽，所得肽可相互連接，通過采用側鏈上的合適保護基團和通過采用能除去固體載體上的合成肽而不使它們脫保護的技術。因此，任意長度的個別肽的合成在本領域中是已知的。

保護和脫保護步驟(在這種固相肽合成中是必需的)，可理解為顯著地損害最終肽產率。此外，可能必需保護肽的氨基酸的側鏈以防它們參與偶聯反應。因此，可能采用能在一系列條件下除去的保護基團。這能選擇性地將氨基酸脫保護。可在一系列條件下除去的保護基團通常稱為“正交保護基團”。

在固相肽合成中，非常需要新的正交保護組(set)。已建立的正交脫保護組是以熟知的氨基酸Fmoc和Boc保護為基礎的。復合肽或糖肽的制備通常需要側鏈氨基官能團的第三正交保護基團，其去除不會影響其它正交組中保護基團，或反過來也是如此。因此，如果所得肽從樹脂上裂解下來后將進行進一步的修飾，則除了在起始固相合成過程中需要保護以外，官能團和側鏈可能需要保護。

由于許多原因，可能需要肽修飾。具體而言，可進行修飾來固定或減少肽可能采取的構象數目。其它情況下，在提高肽與特定目標的結合的嘗試中，可對肽側鏈進行修飾，或者在其它情況下，保護所述肽不被酶及類似物降解。

在一些情況下，已制備了包含環狀基團的肽，由此在氨基酸殘基的側鏈之間產生鍵。在其它情況下，肽的末端被首尾連接從而該肽具有環或環形結構。

通常，以一定的方式制備這些環肽使得所述環通過該肽鏈中存在的天然半胱氨酸殘基氧化而形成，從而產生二硫鍵接結構。這種技術模擬了天然肽和蛋白中最常見的環化形式，但沒有提供制備其它類型環狀結構的便利方法。

GB?1527252提供了包含半胱氨酸基團的肽的環化方法的一個實例。GB?1527252中，將包含至少兩個半胱氨酸部分的肽保持在基本不含氧的溶液中直到所述兩個半胱氨酸部分環化以產生環狀二硫鍵。制備帶有二硫鍵的環肽的其它方法實例在EP?1921087中提供。

為了制備首尾連接的環肽，一種技術是采用具有正交保護官能團的氨基酸，使得一些可在另外一些存在下選擇性地除去。本領域技術人員可采用這些技術在溶液中制備肽，其中氨基末端環化到羧基末端上以形成環。天然實例是抗生短桿菌肽。或者，成對的半胱氨酸殘基氧化成二硫鍵以形成一個或多個環；熟悉的天然環肽激素催產素是這種結構的例子，如已由O′Neil等人，Protein，14，509-515(1992)制備的。然而，這個例子局限于二硫形成環狀六肽的情況。

US?6,008,058公開了采用固相合成生產末端連接(頭尾相連)的環肽的方法。US?6,008,058的環肽在肽鏈仍然與樹脂載體相連時形成。這在US?6,008,058中作為關鍵內容被教導，因為肽的裂解能產生其它問題，如產生二聚體和低聚結構并使表征困難。為了促進末端連接的環肽的形成，US?6,008,058要求存在與樹脂載體相連的多官能氨基酸。這使得與樹脂相連的氨基酸也參與環化。

US?2003/0125243也公開了生產末端連接的肽的方法。采用1-丙烷磷酸環酐進行環化。

WO?01/16162描述了制備環肽的方法，其中芳族基團與所述肽的末端連接，所述芳族基團在所述肽上的氧、硫或氨基之間形成連接。

其它環肽可通過形成C-主鏈連接來制備。在這種方法中，在所述肽主鏈上的碳原子之間形成連接，從而使得氨基酸側鏈上的官能團自由地與靶位點結合。US?2005/0267017公開了環肽及其生產方法，其中在所述肽主鏈上存在的碳原子之間形成環鍵。US?5,723,575也公開了制備主鏈環化肽的方法。

現有技術中公開的環化方法存在一些缺點，這些缺點使得它們不適合用于生產某些目標物。例如，半胱氨酸環化僅在肽具有必需的游離半胱氨酸殘基的情況下合適；主鏈環化僅在肽上存在合適的連接位點的情況下合適。