[發(fā)明專利]使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的肝癌細(xì)胞的檢測法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980116811.5
• 申請日: 2009-03-16
• 公開（公告）號: CN102027372A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 片岡寬章;高居宏武;加藤淳彥;鈴木雅實;杉本正道
• 申請（專利權(quán)）人: 國立大學(xué)法人宮崎大學(xué);中外制藥株式會社
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/48;G01N33/543;C07K16/18
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 楊宏軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測受試者體內(nèi)肝癌細(xì)胞的存在的體外免疫測定方法。

背景技術(shù)

由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中頻繁地高度表達(dá)，所以認(rèn)為肝癌中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表達(dá)概況分析可能對磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中的功能鑒定、肝癌的治療或診斷及肝癌預(yù)后預(yù)測有用。通常進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)分析時，在病理診斷中廣泛采用免疫組織化學(xué)，特別是酶抗體法。免疫組織化學(xué)是使用抗體或酶等生物學(xué)試劑以高靈敏度且特異性地檢測生物體內(nèi)物質(zhì)(抗原)的存在和分布的方法。作為免疫組織化學(xué)的特征，可以舉出以下特征：1、操作簡便；2、可以廣泛應(yīng)用于將所得生物化學(xué)信息用于形態(tài)學(xué)信息等；3、提供生物學(xué)和病理學(xué)方面的重要信息；4、需要注意因使用生物學(xué)試劑所以與通常的方法不同。另外，免疫組織化學(xué)染色還具有下述優(yōu)點，即，能夠使用新鮮冷凍切片、細(xì)胞學(xué)樣本或固定組織的石蠟切片等廣泛的樣本，將其用于目標(biāo)病理診斷或形態(tài)學(xué)觀察。

在免疫組織化學(xué)法中，由于基于酶抗體法的免疫染色可以采用通常病理診斷中使用的福爾馬林固定石蠟包埋組織，所以其應(yīng)用范圍非常廣泛。但是，如果不充分注意由于是福爾馬林固定組織而引起的人為產(chǎn)物(Artifacts)等，那么不僅染色會失敗，有時還會引起因福爾馬林固定及包埋導(dǎo)致的抗原變化、及抗體的滲透和反應(yīng)性的變化，結(jié)果產(chǎn)生假陽性或假陰性。上述假陽性或假陰性有時會導(dǎo)致對染色結(jié)果的曲解。

通常的組織學(xué)檢索中使用的福爾馬林固定對形態(tài)保持有用，但從保持與抗體的結(jié)合性的觀點考慮，福爾馬林不是理想的固定液。因此，除福爾馬林之外有時還使用乙醇等作為固定液，但尚未確立形態(tài)保持優(yōu)異、能夠保存所有抗原與抗體的結(jié)合性的固定法。因此，雖然福爾馬林固定在保持與抗體的結(jié)合性方面存在問題，但仍然是廣泛使用的實際固定法。

因此，為了減弱福爾馬林固定對保持與抗體的結(jié)合性的影響，已經(jīng)公開了幾種方法。第一種方法是選擇識別下述表位的抗體用于免疫染色，所述表位不受福爾馬林固定影響。在識別同一抗原的抗體中，通過將識別抗原中的不易受福爾馬林固定影響的表位的抗體用于免疫染色，可以減少假陰性。但是磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在細(xì)胞表面表達(dá)后，經(jīng)過蛋白酶等翻譯后修飾，因此限定了能夠與抗體結(jié)合的表位，從而不存在用于選擇合適的表位的表位多樣性。

第二種方法是通過提高免疫染色的靈敏度檢測出用通常的方法無法進(jìn)行可視化的抗原。最簡便的方法是在顯色時向通常免疫染色中使用的DAB(3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽)中加入銅等重金屬，但不能期待靈敏度顯著提高。還嘗試了下述方法，即ABC(抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合體(avidin-biotinylatedperoxidase?complex))法及LSAB(標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白生物素化抗體(labeled?streptavidin?biotinylated?antibody))法等，所述方法通過使生物素化的二次抗體和ABC或酶標(biāo)記的抗生物素蛋白與切片反復(fù)反應(yīng)來提高靈敏度，但確認(rèn)了存在隨著反應(yīng)次數(shù)增加背景的非特異性染色也增強的傾向。進(jìn)而，已經(jīng)開始采用下述方法，即使用酶標(biāo)記葡聚糖聚合物的EPOS(增強聚合物一步染色(enhanced?polymerone-step?staining))法、及組合了生物素化Tyramide與ABC法的CSA(催化信號擴增(catalyzed?signal?amplification))法，可以顯著提高染色的靈敏度。但是，采用ABC法等現(xiàn)有方法檢測福爾馬林固定組織中的抗原時，將腫瘤組織判斷為陽性，并且將正?；蚍悄[瘤組織判斷為陰性，基于以上判斷可以識別腫瘤組織和非腫瘤組織，但由于使用高靈敏度方法時也會檢測出非腫瘤組織內(nèi)的微量抗原，所以有時利用抗原也無法進(jìn)行上述識別。另外，在使用高靈敏度方法的情況下，由于靈敏度高，所以仍然存在背景染色增強的問題。

第三種方法是將因福爾馬林固定導(dǎo)致與抗體的反應(yīng)性減弱的抗原的反應(yīng)性活化的方法。在20世紀(jì)70年代引入的利用了蛋白酶的消化切片的方法(蛋白酶誘導(dǎo)表位活化法(protease-induced?epitoperetrieval?method)，以下稱作“PIER法”或“蛋白酶抗原活化法”)中，在免疫染色之前利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等進(jìn)行消化切片。該方法存在下述問題：因切片自身被消化導(dǎo)致的切片從玻璃上剝離、及染色結(jié)果不穩(wěn)定等。