[發明專利]用含有三鏈形成單體單元的引物進行的靶擴增和測序

無效

• 申請號: 200980116715.0
• 申請日: 2009-03-10
• 公開（公告）號: CN102016076A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發明（設計）人: G·里斯貝
• 申請（專利權）人: 昆特拜克股份公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/00
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

背景技術

核酸的檢測、靶擴增和測序是分子生物學、研究以及臨床診斷中的關鍵方法，這些方法中的關鍵試劑為用作引物和/或探針的寡核苷酸。

對于引物和探針最重要的是它們的序列特異性以及它們對互補核酸的親和性。這些特性可通過核苷酸的內在因素和核苷酸的外在因素進行調整。內在因素為例如寡核苷酸的長度和核酸序列組成。非天然核酸的使用或骨架修飾也為內在因素。然而，可用的非天然核苷酸和骨架單元的數量是有限的。因此，存在對可用于分子生物學方法的含有新的修飾的寡核苷酸的需要。

專利申請WO?2006/125447描述了式Z(下文所述)的三鏈形成單體單元，并證明了包含三鏈形成單體單元的寡核苷酸在與雙鏈核酸形成三鏈方面的有利特性。基于所述三鏈形成特性，前述專利申請的發明人建議將所述寡核苷酸用于檢測、診斷和治療。這些應用的細節或數據沒有提供。

Filichev等人(Filichev?VV，2005)描述了與WO?2006/125447相同的三鏈形成單體單元，并發現通過摻入所述三鏈形成單體單元可穩定平行雙鏈和平行三鏈。此外，他們還發現當三鏈形成單體單元插入到寡核苷酸中時，與天然寡核苷酸相比，Watson-Crick型RNA/DNA和DNA/DNA雙鏈會失去穩定性。

附圖說明

圖1：含有1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基團的嵌入核酸單體的合成。

圖2：含有薗頭(Sonogashira)型修飾的嵌入核酸單體的合成。

(i)8與3或9與2的反應都使用Pd(PPh3)4、CuI、DMF/Et₃N和Ar。(ii)32％的NH₄OH或50％的三(2-氨基乙基)胺的乙醇溶液，室溫2小時，然后55℃過夜。(iii)RP-HPLC；80％的AcOH的水溶液，3M的AcONa的水溶液，99％EtOH。

圖3：2-和4-乙炔基芘連接到(R)-1-O-苯基甲基甘油的對位和鄰位上的合成以及它們在寡核苷酸中的摻入。合成的試劑和條件如下：i)H₂(160大氣壓)、10％Pd/C、EtOAc、60℃、24小時；ii)Ac₂O₂、AlCl₃、Ch₂Cl₂、5℃；iii)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)、甲苯、110℃、1小時；iv)DMF、POCL₃；v)KOH、二噁烷、回流、2小時。

圖4：1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基團。

發明內容

本發明人已發現三鏈形成單體單元(本文也稱為TINA單體)摻入到寡核苷酸中意料不到地使所述寡核苷酸具有若干有利特性。此外，他們還已發現含有三鏈形成單體的寡核苷酸可用作酶法操作例如引物延伸的底物。

因此，本發明的第一方面是長度在5到60nt(核苷酸)之間的寡核苷酸，其包含至少一個式Z的TINA單體單元，其中所述TINA單體位于距離所述寡核苷酸的3′末端至少1個單體的位置上。

所述寡核苷酸可用于多種分子生物學方法。

因此，本發明的第二方面為一種方法，包括如下步驟：

a.提供模板核酸

b.提供一種第一引物

c.提供聚合酶

d.提供核苷三磷酸

e.混合步驟a-d的組分并提供使所述引物與所述模板退火的條件

其中所述引物優選本發明的寡核苷酸。

所述步驟可為例如如下的分子生物學技術的一部分：測序反應、轉錄反應或核酸靶擴增方法(NAT)——例如聚合酶鏈式反應(PCR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉錄介導的擴增(TMA)、鏈置換擴增(SDA)或連接酶鏈式反應(LCR)。如果所述步驟是NAT反應的一部分，可簡單地進行NAT反應以擴增所述模板核酸的靶區域。或者，可定量進行NAT以測定所述模板核酸的靶區域的量。定量NAT(例如PCR)反應可包括可以是本發明寡核苷酸的檢測探針。

本發明寡核苷酸的優點在于其使得寡核苷酸的解鏈溫度可以改變，本發明寡核苷酸具有更高的序列特異性，并且可通過與雙鏈核酸的Hoogsteen堿基配對或反向Hoogsteen堿基配對形成三鏈。此外，本發明寡核苷酸的某些實施方案還具有有用的熒光特性。

具體實施方式

本發明的寡核苷酸