[發(fā)明專利]用含有三鏈形成單體單元的引物進(jìn)行的靶擴(kuò)增和測序

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980116715.0
• 申請日: 2009-03-10
• 公開（公告）號: CN102016076A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: G·里斯貝
• 申請（專利權(quán)）人: 昆特拜克股份公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/00
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

1.一種長度在5到60nt之間的寡核苷酸，其包含式Z的TINA單體，其中所述TINA單體位于距離所述寡核苷酸的3’末端至少1個(gè)單體的位置上，并且其中Z表示為如下通用結(jié)構(gòu)：

X-L-I₁-C-I₂

其中X為可摻入寡核苷酸或寡核苷酸類似物或者PNA或PNA類似物的骨架中的骨架單體單元；L為接頭；I₁為包含至少一個(gè)基本為平面共軛體系的第一嵌入劑，所述體系能夠與DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊；C為任選的連接部分；I₂為包含至少一個(gè)基本為平面共軛體系的第二嵌入劑，所述體系能夠與DNA、RNA或其類似物的核苷堿基共堆疊。

2.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中Z可表示為下式：

-其中R選自芳乙炔基基團(tuán)。

3.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，包含選自2、3、4、5、6和7個(gè)的多個(gè)TINA單體，其中所述TINA單體位于距離所述寡核苷酸的3’末端至少1個(gè)單體的位置上。

4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，還包括選自DNA單元、RNA單元、LNA單元和2′-OH-修飾單元的修飾的核苷酸單體單元。

5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’末端包含一段3個(gè)脫氧核苷酸的連續(xù)片段。

6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述TINA單體單元位于距離所述寡核苷酸的5’末端不超過3個(gè)單體的位置上。

7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，還包含限制性酶切位點(diǎn)。

8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，還包含一種選自如下的熒光團(tuán)：FAM^TM、TET^TM、JOE^TM、VIC^TM、綠；6FAM、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、熒光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、得克薩斯紅、若丹明、若丹明綠、若丹明紅、6-羧基若丹明6G、俄勒岡綠488、Alexa?Fluor、俄勒岡綠500或俄勒岡綠514。

9.權(quán)利要求8的寡核苷酸，還包含一種選自如下的淬滅染料：TAMRA^TM；Black?Hole?Quencher^TM、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、DDQ?I、DDQ?II和Eclipse?Dark?Quencher。

10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其含有內(nèi)部間隔基例如C18間隔基、PEG間隔基、C9間隔基、C7間隔基、C6間隔基、環(huán)己烷間隔基、環(huán)辛烷間隔基、環(huán)氧乙烷間隔基或它們的任何組合，并且所述間隔基位于距離所述寡核苷酸的5’末端至少3個(gè)核苷酸并距離所述寡核苷酸的3’末端至少3個(gè)核苷酸的位置上。

11.一種方法，包括如下步驟：

a.提供模板核酸

b.提供一種第一引物

c.提供聚合酶

d.提供核苷三磷酸

e.混合步驟a-d的組分并提供使所述引物可與所述模板退火的條件。

12.權(quán)利要求11的方法，還包括：

f.在可使引物延伸的條件下，延伸與所述模板退火的第一引物。

13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述第一種引物為權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中所述的寡核苷酸。

14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中所述引物或核苷三磷酸為熒光標(biāo)記的。

15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷三磷酸的一部分為雙脫氧核苷三磷酸。

16.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法，還包括如下步驟：

g.提供一種第二引物，其與步驟f的第一延伸產(chǎn)物互補(bǔ)

h.使步驟f的產(chǎn)物變性

i.在可使引物延伸的條件下，延伸與所述第一延伸產(chǎn)物退火的第二引物。

17.權(quán)利要求16的方法，其中所述第二引物為權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中所述的寡核苷酸。

18.權(quán)利要求17的方法，包括將變性、退火和延伸重復(fù)進(jìn)行至少10次。