[發(fā)明專利]β-淀粉酶、編碼其的基因和其制造方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200980116459.5
• 申請(qǐng)日: 2009-04-21
• 公開（公告）號(hào): CN102016033A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 松永亞希子;天野仁;山口莊太郎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天野酶株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N9/26;C12P19/12;C12P19/22
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 苗堃;金世煜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及新的β-淀粉酶。具體涉及微生物來(lái)源的β-淀粉酶、其基因、其制造方法等。

背景技術(shù)

以往，已知β-淀粉酶來(lái)源于大豆、小麥、大麥、麥芽、白薯、馬鈴薯等植物。其中，從大豆、小麥、大麥、麥芽等谷類中提取并純化的β-淀粉酶，由于用于制造在制糖業(yè)、面包制造業(yè)、和釀造工業(yè)中使用的含有麥芽糖的糖漿等，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)中。植物起源的β-淀粉酶中，大豆來(lái)源的β-淀粉酶的酶活性高，耐熱性也優(yōu)異。

然而，近年來(lái)，由于生物乙醇的需求擴(kuò)大，因而玉米的價(jià)格高漲。受此影響，種植由大豆、小麥轉(zhuǎn)向玉米。因此，大豆、小麥、大麥等變得短缺，價(jià)格高漲，現(xiàn)在要確保β-淀粉酶的原料也變得困難了。

β-淀粉酶是一種作用于主鏈為淀粉、糖原等葡萄糖的α-1，4鍵的多糖類，并從非還原性末端、以麥芽糖為單元分解的酶。以前就已了解β-淀粉酶存在于大豆、麥類等高等植物中。自1972年，發(fā)表了微生物中也存在呈現(xiàn)與高等植物β-淀粉酶相同作用機(jī)制的酶以來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多微生物是β-淀粉酶生產(chǎn)菌(非專利文獻(xiàn)1)。

迄今為止，已經(jīng)報(bào)到了蠟樣芽胞桿菌(Bacillus?cereus)、多粘芽孢桿菌(Bacillus?polymyxa)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacillus?circulans)、巨獸芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)、以及嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus?stearothermophilus)等芽孢桿菌屬、或鏈霉菌屬(Streptomyces?sp.)、或假單胞菌屬(Pseudomonas?sp.)等為生產(chǎn)β-淀粉酶的菌。然而，它們大多生產(chǎn)低，很少能達(dá)到實(shí)用化。

另一方面，曲霉菌屬等絲狀菌生產(chǎn)的淀粉酶按末端型分解直鏈淀粉、支鏈淀粉。因此，在使用該淀粉酶時(shí)，除了麥芽糖之外，大多還生成葡萄糖、麥芽三糖、其它寡糖。而且，該淀粉酶耐熱性也低，作為麥芽糖生產(chǎn)用的實(shí)用性低。

嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus?stearothermophilus)生產(chǎn)耐熱性高的麥芽糖生成酶(專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)。該酶從淀粉的非還原性末端開始，按外切型生成麥芽糖，但生成的麥芽糖為α型。而且，據(jù)報(bào)道，該酶不是像植物起源的β-淀粉酶那樣嚴(yán)密地按麥芽糖單元加水分解，而是在反應(yīng)初期，生成麥芽四糖(G4)、麥芽三糖(G3)和麥芽糖(G2)，以及少量麥芽戊糖(G5)和麥芽己糖(G6)，將Shardinger糊精分解為麥芽糖和葡萄糖，并將麥芽三糖分解為麥芽糖和葡萄糖。因此，淀粉分解物中由于該酶的作用而含有6～8％的葡萄糖。因此，該酶不適于高純度的麥芽糖糖漿的制造。

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：特開昭60-2185號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：工業(yè)用糖類酶手冊(cè)(工業(yè)用糖質(zhì)酵素ハンドブツク)、講談社サイエンテイフイツク、1999年

非專利文獻(xiàn)2：H.Outtrup和B.E.Norman等Starch，第12卷、第405～411頁(yè)

發(fā)明內(nèi)容

如上文所述，對(duì)于現(xiàn)在β-淀粉酶的主流的植物起源的β-淀粉酶而言，難以進(jìn)行穩(wěn)定的供應(yīng)。而且，從植物中獲得的酶量一定，其生產(chǎn)量有限度。另一方面，微生物來(lái)源的β-淀粉酶，由于生產(chǎn)率低、或大量培養(yǎng)困難等原因，很少能實(shí)現(xiàn)實(shí)用化。

本發(fā)明人鑒于上述問題，反復(fù)進(jìn)行了積極的研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為枯草菌的彎曲芽孢桿菌(Bacillus?flexus)生產(chǎn)具有與大豆來(lái)源的β-淀粉酶相匹敵的耐熱性的β-淀粉酶。此外，本發(fā)明人分離并純化了該β-淀粉酶，并成功地測(cè)定了該酶化學(xué)性質(zhì)。此外，還成功測(cè)定了編碼該β-淀粉酶的基因的堿基序列。另外，確認(rèn)了采用導(dǎo)入了含有該基因的載體的轉(zhuǎn)化體，可以制造β-淀粉酶。

本發(fā)明基于以上成果而完成，內(nèi)容如下。

[1]彎曲芽孢桿菌(Bacillus?flexus)來(lái)源的β-淀粉酶。

[2]具有下述酶化學(xué)性質(zhì)的β-淀粉酶：

(1)作用：作用于多糖類和寡糖類的α-1，4糖苷鍵，將麥芽糖游離；

(2)底物特異性：良好地作用于淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、麥芽四糖、麥芽戊糖、麥芽己糖、麥芽庚糖，而不作用于普魯蘭多糖(pullulan)、葡聚糖、環(huán)糊精、麥芽三糖；

(3)最適溫度：約55℃；

(4)最適pH：約8.0；

(5)溫度穩(wěn)定性：在55℃以下穩(wěn)定(pH?5.0、10分鐘)；

(6)pH穩(wěn)定性：在pH?4～9穩(wěn)定(30℃、3小時(shí))；

(7)分子量：約60000(SDS-PAGE)。