[發(fā)明專利]用于核酸測試的非競爭性內(nèi)部對照物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200980109445.0
• 申請日: 2009-03-19
• 公開（公告）號: CN101978074A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J·德特默;X·蔣;M·樂;D·謝爾曼
• 申請（專利權(quán)）人: 西門子醫(yī)療保健診斷公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 周鐵;林森

技術(shù)領(lǐng)域

本申請一般地涉及用于進(jìn)行診斷分析的工具，更具體地涉及用于核酸測試(NAT)的不與目標(biāo)核酸序列競爭的內(nèi)部對照序列。

發(fā)明背景

為了確保核酸測試(NAT)正確地進(jìn)行，分析需要存在內(nèi)部對照物。在診斷NAT中，內(nèi)部對照物的存在可以確保測試的完整性。具體地，通過在NAT中包括內(nèi)部對照物，內(nèi)部對照物和目標(biāo)核酸測試為陽性的樣品是真陽性的。相反，僅測試了內(nèi)部對照物的樣品是真陰性的，僅測試了目標(biāo)核酸的樣品是真陰性的，沒有可檢測的內(nèi)部對照物或目標(biāo)的樣品是假陰性的。

需要存在內(nèi)部對照物的最常用的診斷分析是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析，其在它的傳統(tǒng)用途中是目標(biāo)擴(kuò)增分析，在它的修改的用途中是目標(biāo)擴(kuò)增和定量分析。存在幾種類型的PCR分析：傳統(tǒng)的PCR(DNA的擴(kuò)增)；反-轉(zhuǎn)錄酶PCR(也稱為“RT-PCR”；利用RNA作為起始材料的DNA的擴(kuò)增)，實時PCR(DNA的同時定量和擴(kuò)增)；和實時RT-PCR(利用RNA作為起始材料的DNA的同時定量和擴(kuò)增)。

在擴(kuò)增分析，例如PCR分析中，一般地，使用一種或兩種內(nèi)部對照物：競爭性內(nèi)部對照物和非競爭性內(nèi)部對照物。

使用競爭性內(nèi)部對照物，目標(biāo)和所述內(nèi)部對照物在同樣的條件下和在同一PCR試管中使用一組共同的引物來擴(kuò)增。使用競爭性內(nèi)部對照物，內(nèi)部對照物核酸側(cè)翼是用于啟動目標(biāo)核酸的擴(kuò)增的相同的引物序列。當(dāng)正確地進(jìn)行PCR分析時，IC核酸將在擴(kuò)增分析之后檢測到。根據(jù)它的名字知道的是，競爭性內(nèi)部對照物是基于目標(biāo)DNA和內(nèi)部對照物之間的競爭。為了使競爭性內(nèi)部對照物有效，樣品試管中的內(nèi)部對照物的數(shù)量對于檢測極限是關(guān)鍵的。使用競爭性內(nèi)部對照物的缺點是基于它的結(jié)構(gòu)，具體地，取決于核酸片段的摩爾比、長度、序列和二級結(jié)構(gòu)，側(cè)翼是相同的引物位點的兩種不同的核酸片段的同時擴(kuò)增有著一種或兩種產(chǎn)物的抑制作用或增強(qiáng)作用的風(fēng)險。競爭性內(nèi)部對照物的另一個缺點是，它們不能用于多重分析，多重分析在單次分析中篩選多個目標(biāo)。

對于非競爭性內(nèi)部對照物，對每一種利用不同的引物組擴(kuò)增目標(biāo)和內(nèi)部對照物；因而，非競爭性內(nèi)部對照物需要一種PCR，在其中具有不同動力學(xué)的兩個反應(yīng)同時地進(jìn)行。由于兩種反應(yīng)的動力學(xué)是不同的，對于引物沒有競爭。當(dāng)前使用的非競爭性內(nèi)部對照物引物組一般靶向目標(biāo)基因以外的基因(例如，編碼rRNA)，其以比目標(biāo)基因更高的拷貝數(shù)存在于樣品中。本領(lǐng)域中最常用的非競爭性內(nèi)部對照物利用特異于16S和23S核糖體DNA的保守序列的引物。本領(lǐng)域中仍然需要可以被制備用于多重分析的其他非競爭性內(nèi)部對照物。非競爭性內(nèi)部對照物的優(yōu)點是，不同于競爭性內(nèi)部對照物，非競爭性內(nèi)部對照物可以被保存用于多個反應(yīng)，也可以用于多重反應(yīng)中。本領(lǐng)域中需要這樣的非競爭性內(nèi)部對照物。

發(fā)明概述

通過提供核酸序列，所述核酸序列可以在實驗室中制備，并保存用于多個反應(yīng)和用于多重NAT，本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中對用于NAT的非競爭性內(nèi)部對照物的需求。

在本發(fā)明的一個方面，提供了用于核酸測試(NAT)的非競爭性內(nèi)部對照物，包含從選自Methanobacterium?thermoautrophicum(MET)和玉蜀黍(Zea?mays)的生物體獲得的核酸。

在本發(fā)明的一個實施方式中，所述非競爭性內(nèi)部對照物包含DNA，并用于選自由甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞體病毒(RSV?A)、RSV?B、人類偏肺病毒(human?metapneumovirus，hMPV)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)(CT)、Neisseria?gonorrhea(GC[用于gonococci])和乙型肝炎病毒(HBV)構(gòu)成的組的DNA?NAT。

在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述非競爭性內(nèi)部對照物包含RNA，并用于選自由丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒I(HIV-1)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)構(gòu)成的組的RNA?NAT。

在本發(fā)明的另一個方面，提供了制備用于核酸測試(NAT)的非競爭性內(nèi)部對照物的方法，包括步驟：(a)從Methanobacteriumthermoautrophicum(MET)提取基因組DNA；(b)利用具有至少兩個限制性內(nèi)切酶位點和至少一個目標(biāo)特異性序列的正向和反向引物，從步驟(a)的基因組DNA產(chǎn)生擴(kuò)增子；(c)通過連接步驟(b)的擴(kuò)增子和載體序列產(chǎn)生質(zhì)粒，所述載體序列具有啟動子序列和與所述擴(kuò)增子的限制性內(nèi)切酶位點相同的限制性內(nèi)切酶位點；和(d)用與步驟(b)和(c)的限制性內(nèi)切酶位點相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化所述質(zhì)粒來產(chǎn)生MET內(nèi)部對照DNA。