[發明專利]發酵戊糖的細胞

無效

• 申請號: 200980108009.1
• 申請日: 2009-03-05
• 公開（公告）號: CN101965400A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發明（設計）人: 保羅·克萊斯森;簡·米特斯卡·拉恩·范德;比安卡·伊麗莎白·瑪麗亞·吉勒森;吉斯博蒂娜·皮特奈拉·蘇勒庫姆·范
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12N9/92
• 分類號: C12N9/92;C12P7/10;C12N15/52
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司 11258
• 代理人: 肖善強;南霆

發明領域

本發明涉及能夠將木糖異構化為木酮糖的細胞。本發明還涉及其中使用這類細胞生產發酵產物例如乙醇的方法。

發明背景

最近幾十年，傳統化石燃料(基于石油的燃料)的大規模消耗造成了高水平的污染。這與化石燃料的世界儲備并非有限的認識以及增長的環境意識一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新動機，所述替代性燃料是以每升為基礎比無鉛汽油釋放更少CO₂的無粒子燃燒燃料來源。

盡管生物量衍生的乙醇可以通過得自許多不同來源的己糖的發酵來生產，但是，典型地用于商業規模生產燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂貴的。因此，燃料乙醇生產的提高會需要使用更低成本的原料。

目前，只有衍生自植物生物量的木質纖維素原料能夠足量獲得，用于代替目前用于乙醇生產的作物。在大部分木質纖維素材料中，在葡萄糖之后第二常見的糖是木糖。因此，對于經濟上可行的燃料生產工藝而言，己糖和戊糖均必須被發酵形成乙醇。酵母Saccharomyces?cerevisia是有活力的并且充分適合乙醇生產，但是不能使用木糖作為碳源生產乙醇。另外，沒有一種天然存在的生物是已知能夠以高乙醇產量以及高乙醇生產力將木糖發酵成乙醇的。

因此，對下述生物存在需要，所述生物具有這些特性從而能夠在商業上有活力地從木質纖維素原料生產乙醇。

發明概述

根據本發明，提供了能夠發酵(例如醇發酵)和使用木糖作為碳源的細胞。這樣的細胞包含編碼木糖異構酶的核苷酸序列，其中木糖異構酶的氨基酸序列與SEQ?ID?NO：3中公開的氨基酸序列具有至少約70％的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列對所述宿主是異源的。這樣的細胞在使用木糖作為碳源時，與野生型絲狀真菌相比生產更大量的乙醇。

本發明還提供了

-生產發酵產物的方法，所述方法包括用本發明的細胞發酵含有木糖來源的培養基，使得所述細胞將木糖發酵成所述發酵產物；

-生產發酵產物的方法，所述方法包括用本發明定義的還能夠利用L-阿拉伯糖的細胞發酵至少含有木糖來源和L-阿拉伯糖來源的培養基，使得細胞將木糖和L-阿拉伯糖發酵成為所述發酵產物；和

-生產發酵產物的方法，所述方法包括用本發明的細胞和能夠使L-阿拉伯糖的細胞發酵至少含有木糖來源和L-阿拉伯糖來源的培養基，其中每種細胞將木糖和/或阿拉伯糖發酵成為所述發酵產物。

本發明還提供了本發明的細胞在生產發酵產物的方法中的用途。

附圖概述

圖1公開了用于在Saccharomyces?cerevisiae中表達的編碼來自Bacillus?stearothermophilus(Geobacillus?stearothermophilus菌株T-6)的木糖異構酶的pYISIT4-XKS1-xylA(Bast?CpO)的質粒圖譜。CpO表示經密碼子對優化。

圖2：質粒pPWT080的物理圖譜。

圖3：野生型GRE3-基因座的物理圖譜(圖a)和GRE3-基因座中PWT080的1拷貝整合(展示引物在何處結合的圖b，和展示RKI1-探針在何處結合的圖c)。

圖4：放射自顯影圖，顯示CEN.PK113-7D中1拷貝質粒pPWT080的正確整合。

圖a：染色體DNA制劑的XcmI-消化，與RKI1-探針雜交。第1道：CEN.PK113-7D；第2道：BIE104F1；第3道：BIE104P1

圖b：染色體DNA制劑的PsiI-消化，與RKI1-探針雜交。第1道：CEN.PK113-7D；第2道：BIE104F1；第3道：BIE104P1

GRE3::PPP代表用含有處于強組成型啟動子控制下的基因TAL1、TKL1、RKI1和RPE1的盒代替GRE3-基因的編碼區，GRE3::[TPI1p-TAL1-ADH1p-TKL1-PGI1p-RPE1-ENO1p-RKI1]。

圖5：GRE3-基因座的物理圖譜，其中通過PPP-基因TAL1、TKL1、RKI1和RPE1的整合代替GRE3-基因的編碼區。圖a展示SEQ?ID?5和6引物在何處結合，圖b展示RKI1-探針在何處結合。

圖6：質粒pYI#SIT4的物理圖譜。

圖7：質粒pPWT007的物理圖譜。

圖8：質粒pPWT046的物理圖譜。

圖9：野生型SIT4-基因座(圖a)和SIT4-基因座中pPWT046的1拷貝整合(圖b，展示引物在何處結合)的物理圖譜。