[發明專利]亞硫酸氫化核酸的擴增

無效

• 申請號: 200980103497.7
• 申請日: 2009-02-06
• 公開（公告）號: CN101932731A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 克里斯蒂安·科爾夫哈格;德科·洛斐爾特;拉爾夫·佩斯特;尼古拉斯·拉丁格
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;樊衛民

技術領域

本發明屬于分子生物學和表觀遺傳學領域，涉及核酸的擴增，所述核酸的未甲基化胞嘧啶堿基已經通過亞硫酸氫化反應轉變成尿嘧啶堿基。還公開了用于本發明的核酸擴增的反應混合物和試劑盒，以及用于分析核酸甲基化狀態的方法。

背景技術

表觀遺傳機制引起基因表達的改變，所述改變不伴有基因編碼序列的變化，但是可以例如通過有絲分裂傳遞。在高等真核生物中，研究得最好的表觀遺傳機制除了RNA相關的沉默和組蛋白修飾以外就是DNA甲基化(Serman等，Coll?Antropol.2006；30(3)：665-71)。

DNA在核酸的胞嘧啶殘基上、優選在具有胞嘧啶-鳥嘌呤序列(CpG)的二核苷酸上被甲基化。在真核生物中，最重要的堿基修飾是胞嘧啶5’位處的甲基化。

然而，甲基化的類型可能是不同的，在植物中除CpG甲基化之外已經公開了CNG和不對稱胞嘧啶甲基化，在果蠅(Drosophila)中已經檢測到少量CT甲基化。此外，在各種不同的真菌中，已發現非CG甲基化。所述CpG二核苷酸通常聚集在核酸的相對小(500bp-4kb)的區段中，并且如果GC含量＞55％，被稱為CpG島。CpG島通常被發現在基因調控區附近，并且可能影響所述基因的轉錄調控。在大多數情況下，CpG島的甲基化引起受影響基因的失活，因此在許多生物學過程(印跡(imprinting)、X染色體失活、基因表達)中發揮作用，盡管特別是在良性以及惡性腫瘤的發展(Egger等，Nature.2004；429(6990)：457-63)、在某些表型、疾病和細胞衰老中發揮作用。

因此，分析核酸的甲基化在診斷學中是特別重要的(例如用于癌癥和其他疾病的早期診斷和分類)，同時出于基因調控的目的對甲基化狀態進行靶向修飾，代表了一種可能的治療策略。因此，檢測核酸的甲基化狀態非常重要。

核酸的甲基化狀態可以通過核酸的亞硫酸氫化作用來分析，所述分析包括將所述核酸的未甲基化胞嘧啶堿基轉變成尿嘧啶堿基，同時甲基化的胞嘧啶堿基維持不變。用于分析核酸的甲基化狀態的各種不同技術、特別是亞硫酸氫化作用的綜述，可以在Fraga等，Biotechniques.2002；33(3)：632，634，636-49和Laird，Nat?Rev?Cancer.2003；3(4)：253-66中發現。因此，取決于起始核酸的甲基化狀態，亞硫酸氫化反應產生具有不同序列的核酸序列，然后在尤其是通過PCR或通過測序分析所述序列后，可以推斷起始核酸的甲基化狀態。

取決于細胞的發育狀態和生理狀況，所有胞嘧啶堿基中大約5-15％是甲基化的。因為甲基化的胞嘧啶堿基保持不受亞硫酸氫化反應的影響，這導致起始核酸的所有胞嘧啶堿基中大約85-95％被轉變成尿嘧啶堿基。結果，這為起始核酸提供了基本上新的堿基組成，其中胞嘧啶向尿嘧啶的轉變從G∶C堿基對產生G∶U錯配，因此從那以后，核酸的兩條鏈不再彼此完全互補。產生的錯配可以相當多，因為例如含有5％甲基化胞嘧啶的GC含量為50％的DNA，在亞硫酸氫化作用后可能只具有28％的GC含量。

亞硫酸氫化反應后得到的具有改變的堿基組成的該被轉變的核酸的擴增，特別是在PCR擴增的情況下，可能引起極大困難。因此，對于通過亞硫酸氫化作用轉變的核酸的改進的擴增，存在著需求。本發明為該問題提供了解決方案。

發明簡內容

本發明涉及用于擴增通過亞硫酸氫化轉變的核酸的改進的反應混合物和方法，用于分析核酸甲基化狀態的方法，以及相應的試劑盒。本發明是基于令人吃驚的發現，即利用亞硫酸氫化反應進行了轉變的核酸的擴增，可以通過將反應混合物中核苷酸dATP和dTTP的濃度增加到超過dCTP和dGTP的濃度，來顯著改進。

本發明的一個方面涉及用于核酸擴增的反應混合物，所述反應混合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，以及包含尿嘧啶的核酸，其特征在于dATP和dTTP的起始濃度高于dCTP和dGTP的起始濃度。

特別優選情況下，使用的核苷酸不帶標簽或不被標記，即尤其是不具有任何熒光、發光或重量標志物、含有染料的或染色標志物(特別是酶標志物)、磁性、放射活性、可放射性檢測或免疫標志物、抗原、凝集素或其他可檢測標志物或標記物。

在優選實施方案中，反應混合物中dATP和dTTP的起始濃度為dCTP和dGTP起始濃度的200％到600％。在更優選實施方案中，反應混合物中dATP和dTTP的起始濃度為dCTP和dGTP起始濃度的300％到500％。

本發明的第二方面涉及用于擴增通過亞硫酸氫化反應轉變的核酸的方法，所述方法包括下列步驟：