[發(fā)明專利]亞硫酸氫化核酸的擴(kuò)增無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 200980103497.7 | 申請(qǐng)日： | 2009-02-06 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN101932731A | 公開（公告）日： | 2010-12-29 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 克里斯蒂安·科爾夫哈格;德科·洛斐爾特;拉爾夫·佩斯特;尼古拉斯·拉丁格 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 凱杰有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/68 | 分類號(hào)： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 中原信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11219 | 代理人： | 張穎;樊衛(wèi)民 |
| 地址： | 德國(guó)*** | 國(guó)省代碼： | 德國(guó);DE |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說(shuō)明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 亞硫酸 氫化 核酸 擴(kuò)增 | ||
1.用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，以及包含尿嘧啶的核酸，其特征在于dATP和dTTP的起始濃度高于dCTP和dGTP的起始濃度。
2.權(quán)利要求1的反應(yīng)混合物，其中dATP和dTTP的起始濃度為dCTP和dGTP起始濃度的200％到600％，優(yōu)選為dCTP和dGTP起始濃度的300％到500％。
3.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，還包含至少一組引物。
4.權(quán)利要求3的反應(yīng)混合物，其中至少一組引物對(duì)所有情況下的未亞硫酸氫化的變體特異和/或?qū)怂岬闹辽僖粋€(gè)亞硫酸氫化的變體特異。
5.權(quán)利要求3或4的反應(yīng)混合物，其中至少一組引物對(duì)至少一個(gè)CpG島核酸序列特異，該CpG島核酸序列的甲基化狀態(tài)與表型或疾病相關(guān)。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中dCTP和dGTP的起始濃度是20-3000μM、50-2000μM或100-1000μM。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，還包含至少一種聚合酶。
8.權(quán)利要求7的反應(yīng)混合物，其中聚合酶是鏈置換聚合酶。
9.權(quán)利要求7的反應(yīng)混合物，其中聚合酶是熱穩(wěn)定聚合酶。
10.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中聚合酶選自Phi29-DNA聚合酶，Vent?DNA聚合酶、Deep?Vent?DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、9oNm?DNA聚合酶、Bca?DNA聚合酶、Taq?DNA聚合酶、Tth?DNA聚合酶和/或Klenow?exo?minus?DNA聚合酶，以及上面提到的聚合酶的修飾形式，包括“熱啟動(dòng)聚合酶”。
11.權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其還包含連接酶。
12.用于擴(kuò)增通過(guò)亞硫酸氫化反應(yīng)轉(zhuǎn)變的核酸的方法，所述方法包括下列步驟：
a.將亞硫酸氫化的核酸與至少一組引物、至少一種聚合酶以及dATP、dTTP、dCTP和dGTP接觸；和
b.利用所述至少一種聚合酶擴(kuò)增所述核酸，
其特征在于dATP和dTTP的起始濃度高于dCTP和dGTP的起始濃度。
13.權(quán)利要求12的方法，其中dATP和dTTP的起始濃度為dCTP和dGTP起始濃度的200％到600％，優(yōu)選為dCTP和dGTP起始濃度的300％到500％。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中核酸與至少兩個(gè)相應(yīng)引物組接觸，所述引物組對(duì)所有情況下的未亞硫酸氫化的變體特異和/或?qū)怂岬闹辽僖粋€(gè)亞硫酸氫化的變體特異。
15.權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的方法，其中引物組對(duì)至少一個(gè)CpG島核酸序列特異，該CpG島核酸序列的甲基化狀態(tài)與表型或疾病相關(guān)。
16.權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的方法，其中核酸與5到10、10到20、20到50、50到100、100到250或250個(gè)以上的這種引物組接觸。
17.權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的方法，其特征在于核酸在連接酶存在下進(jìn)行擴(kuò)增。
18.權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的方法，其中擴(kuò)增在等溫下或利用溫度循環(huán)來(lái)進(jìn)行。
19.權(quán)利要求18的方法，其中擴(kuò)增是RCA、MDA、SDA或PCR。
20.用于分析核酸的甲基化狀態(tài)的方法，所述方法包括下列步驟：
a.對(duì)核酸進(jìn)行亞硫酸氫化；
b.按照權(quán)利要求12-19任一項(xiàng)，對(duì)來(lái)自步驟a的亞硫酸氫化的核酸進(jìn)行擴(kuò)增；以及
c.檢測(cè)由于所述亞硫酸氫化從胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶的核酸堿基，
其中每個(gè)檢測(cè)到的尿嘧啶對(duì)應(yīng)于原始核酸中存在的未甲基化的胞嘧啶。
21.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物或權(quán)利要求12-20任一項(xiàng)的方法，其中核酸是DNA。
22.權(quán)利要求21的反應(yīng)混合物或方法，其中DNA是基因組DNA或線粒體DNA。
23.試劑盒，具有權(quán)利要求1-11和/或21-22任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物。
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