[發明專利]高純度膠原蛋白的制備

有效

• 申請號: 200980101280.2
• 申請日: 2009-07-27
• 公開（公告）號: CN102131403A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 黃玲惠
• 申請（專利權）人: 成功大學;惠合再生醫學生技股份有限公司
• 主分類號: A23L1/0562
• 分類號: A23L1/0562;A23L1/015
• 代理公司: 北京中原華和知識產權代理有限責任公司 11019
• 代理人: 壽寧

技術領域

本發明有關于一種膠原蛋白制備方法。

背景技術

膠原蛋白是一種纖維蛋白(fibrous?protein)，其可在軟骨、筋腱、真皮組織以及其它結締組織中發現。膠原蛋白已廣泛運用于工業以及醫藥。

膠原蛋白一般藉由可將非膠原蛋白物質移除的反復酸溶或酵素處理，而由結締組織純化出來。此種處理需重復數次以改善膠原蛋白的純度。重復處理不僅會拉長純化工藝，更會導致膠原蛋白產率低。

因而需要一種新穎的高純度膠原蛋白制備方法。

發明內容

因此，本發明的特征為一種高純度膠原蛋白制備方法，其先由一結締組織(例如真皮組織或筋腱)制造一膠原蛋白基質，然后再由基質萃取出膠原蛋白。詳細言之，此方法包含下列步驟：(i)提供一結締組織，其表面積為20平方毫米(mm²)至2平方公尺(m²)(例如，25平方公厘至900平方公分)；(ii)以一第一酸液使該結締組織的體積至少膨脹百分之五十(較佳為100％至500％)而形成一膨脹結締組織；(iii)清洗該膨脹結締組織以除去非膠原蛋白物質藉此形成一膠原蛋白基質；以及(iv)利用一萃取液從該膠原蛋白基質萃取出膠原蛋白，藉此制造一含有膠原蛋白的溶液。

上述的膨脹步驟可藉由將結締組織浸泡于該第一酸液而達成。較佳地，上述的浸泡步驟藉由同時將一液體噴射至結締組織或同時以一超音波處理結締組織而達成。上述的結締組織源自真皮組織或筋腱。該第一酸液的pH值為1至6(較佳為2至4)，且該第一酸液實質上不包含鹽類，也就是說溶液中沒有鹽類成分，或者是鹽類濃度非常低，使得溶液的離子強度不大于0.005M。上述的酸液可由甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸或其混合物來制備。較佳的是，上述酸液為0.1-6M的醋酸溶液。

在上述的膨脹步驟之后，將膨脹后的結締組織加以清洗以除去非膠原蛋白物質，藉此制備出一膠原蛋白基質。上述的清洗步驟可藉由將該膨脹結締組織浸泡于一清洗液而達成，該清洗液可以進一步包含清潔劑、蛋白水解酶或其混合物；在上述浸泡或清洗步驟中，可將該膨脹結締組織以超音波處理或以液體噴射處理。

然后將前述膠原蛋白基質浸于一萃取液中，藉此形成一含有膠原蛋白的溶液。該萃取液可以是含有弱有機酸(例如甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸或其混合物)的酸液，該酸液的pH值適于溶解膠原蛋白(較佳為小于4)。此外，該萃取液可以是含有鹽(例如氯化鈉或氯化鉀)的中性溶液(例如0.05M的Tris緩沖溶液)，該鹽的濃度適于溶解膠原蛋白(例如大于1M)。在一實施例中，膠原蛋白藉由下列步驟從該膠原蛋白基質萃取出：研磨該膠原蛋白基質而制得膠原蛋白粉末，以及將該膠原蛋白粉末與該萃取液混合而制得該含有膠原蛋白的溶液。該研磨步驟以及該混合步驟可同時進行。

接著，可以習用方法將膠原蛋白由該含有膠原蛋白的溶液中沉淀。在一實施例中，該膠原蛋白藉由透析法沉淀。在另一實施例中，將該含有膠原蛋白的溶液與一鹽以1M至4M的濃度混合來使膠原蛋白沉淀；如此獲得的膠原蛋白較佳需進行脫鹽。在又一實施例中，將該含有膠原蛋白的溶液的pH值調整至4.5到8來使膠原蛋白沉淀。

制得的膠原蛋白可加以冷凍干燥、空氣干燥或真空干燥而形成膠原蛋白粉末、膠原蛋白海綿狀物(sponge)、膠原蛋白片狀物或膠原蛋白膜。制得的膠原蛋白粉末可分散于一酸液中而形成一膠原蛋白分散溶液，制得的膠原蛋白粉末亦可以蛋白水解酶處理以制造無端肽膠原蛋白(atelopeptide?collagen)。蛋白水解酶的例子包含，但不限于，胃蛋白酶(pepsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、膠原蛋白酶(collagenase)、無花果蛋白酶(ficin)、木瓜蛋白酶(papain)、勝肽酶(peptidase)、蛋白酶A(proteinaseA)、蛋白酶K(proteinase?K)、胰蛋白酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbialproteases)及其混合物。

下文特舉本發明一些實施例作詳細說明如后。本發明的其他目的或特征將呈現于后述實施例以及后附的申請專利范圍。

具體實施方式

膠原蛋白長約300奈米(nm)，直徑約1.5奈米(nm)。大量的膠原蛋白分子形成膠原蛋白纖維絲，而一束膠原蛋白纖維絲形成一膠原蛋白纖維。膠原蛋白分子之間以及膠原蛋白分子內部存在著共價的交聯，藉此在結締組織內形成了纖維狀的網絡。