[發(fā)明專利]腐蝕穩(wěn)定性色譜分析用配體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200911000241.1
• 申請日: 2009-12-23
• 公開（公告）號: CN101775069A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發(fā)明（設計）人: N·卞;N·索伊斯;S·斯佩克特;K·萊文
• 申請（專利權(quán)）人: 米利波爾公司
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;C07K1/22;C07K16/00;G01N30/50;G01N33/566
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

相關(guān)申請

本申請要求申請?zhí)枮镹o.61/203,664，申請日為2008年12月24日的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此全部并入本申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有提高的腐蝕穩(wěn)定性的色譜分析用配體，例如，基于免疫球蛋白結(jié)合蛋白(如，葡萄球菌A蛋白)的配體，以及包含此類配體的色譜分析基質(zhì)。

背景技術(shù)

在親和色譜分析中使用的配體通常賦予對靶分子的高選擇性，因此導致了對靶分子的高收率以及快速而經(jīng)濟的純化。基于葡萄球菌A蛋白(SpA)的試劑以及色譜分析基質(zhì)達到了在捕獲和純化抗體的親和色譜分析中的廣泛應用，并且由于其結(jié)合IgG而對免疫球蛋白和抗體的親和性沒有顯著影響的能力，其同樣廣泛應用于抗體檢測方法。

據(jù)此，已經(jīng)開發(fā)了多種包含A蛋白—配體的試劑以及介質(zhì)，并且在商業(yè)上可獲得，包括，例如，ProSep-vA?High?Capacity，ProSepvA?Ultra和ProSepUltraPlus(Millipore)及Protein?A?Sepharose^TM，MabSelect^TM，MabSelect?Xtra^TM和MabSelect?SuRe(GE?Healthcare)和Poros?MabCaptureA^TM(Applied?Biosystems)。

為了維持色譜分析用配體(所述配體包括，如，包含基于SpA的色譜分析用配體的樹脂)的選擇性和結(jié)合能力，需要對配體結(jié)合樹脂(稱作色譜分析基質(zhì))進行清潔，并且通常在堿性條件下清洗，如，使用氫氧化鈉。舉例來說，用于清洗和復原基質(zhì)的標準過程是一種原位清洗(Cleaning-in-place，CIP)的堿性方案，一般包括使用pH14的1M?NaOH對基質(zhì)進行處理。但是，這種不太溫和的處理經(jīng)常是不期望的，當配體是一種蛋白或是基于蛋白的分子時尤其如此。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了具有堿穩(wěn)定性的基于SpA的色譜分析用配體，例如，其能夠耐受重復的原位清洗(CIP)循環(huán)。更特別的是，基于本發(fā)明的配體可以在延長的時間中耐受傳統(tǒng)的堿性清洗，這使得所述配體成為引人注目的候選物，特別是對于免疫球蛋白進行低成本高效率且高水平的純化而言尤為如此。

在本發(fā)明的一個方面，堿穩(wěn)定性色譜分析用配體包含兩個或更多個SpA結(jié)構(gòu)域。例如，在這方面的一些實施方式中，提供了堿穩(wěn)定性色譜分析用配體，所述配體包含兩個或更多個葡萄球菌A蛋白(SPA)或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者兩個或更多個SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域，所述兩個或更多個B結(jié)構(gòu)域或者兩個或更多個Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點為樹脂上的多于一個位點。

在基于該方面的一些實施方式中，所述配體包含三個或更多個SpA或其功能性片段或變體的B結(jié)構(gòu)域或者三個或更多個SpA或其功能性片段或變體的Z結(jié)構(gòu)域，所述三個或更多個B結(jié)構(gòu)域或者三個或更多個Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點為樹脂上的多于一個位點。在另一些實施方式中，所述配體包含四個或更多個SpA?B結(jié)構(gòu)域或者四個或更多個SpA?Z結(jié)構(gòu)域，所述四個或更多個B結(jié)構(gòu)域或四個或更多個Z結(jié)構(gòu)域被附著在色譜分析樹脂上，附著位點為樹脂上的多于一個位點。在其它實施方式中，所述配體包含五個或更多個SpA?B結(jié)構(gòu)域或五個或更多個SpA?Z結(jié)構(gòu)域；或包含六個或更多個SpA?B結(jié)構(gòu)域或六個或更多個SpA?Z結(jié)構(gòu)域；或包含七個或更多個SpA?B結(jié)構(gòu)域或七個或更多個SpA?Z結(jié)構(gòu)域，所述五個或更多個B結(jié)構(gòu)域或五個或更多個Z結(jié)構(gòu)域，六個或更多個B結(jié)構(gòu)域或六個或更多個Z結(jié)構(gòu)域，七個或更多個B結(jié)構(gòu)域或七個或更多個Z結(jié)構(gòu)域，被附著在色譜分析樹脂上，附著位點為樹脂上的多于一個位點。

基于本發(fā)明的另一方面，堿穩(wěn)定性色譜分析用配體包含一個或多個分離的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z結(jié)構(gòu)域，所述一個或多個分離的結(jié)構(gòu)域包含位于n+1位的一個或多個突變?yōu)槌腚装彼?C)、絲氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸殘基。在一些實施方式中，n代表分離的SpA結(jié)構(gòu)域的23位天冬酰胺殘基。在分離的SpA結(jié)構(gòu)域的24位具有突變的示例性配體如表1所示，其中n代表天冬酰胺。

表1