[發明專利]豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200910310225.6
• 申請日: 2009-11-23
• 公開（公告）號: CN101705310A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 崔立;華修國;郭偉;商曉桂;單同領
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種檢驗技術領域的檢測方法，具體是一種豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

星狀病毒屬于一個新的病毒家族即星狀病毒科，星狀病毒屬。該病毒于1975年首先由ApPleton和Hgigins用電鏡檢測急性胃腸炎患兒糞便時發現。病毒顆粒直徑28nm，因電鏡下可觀察到約10％的病毒顆粒表面有5～6個星狀突起，故而得名。星狀病毒廣泛分布于世界各地，并報道與豬、犬、鹿、水貂、鼠、貓、羊等多種動物腹瀉性疾病有關。豬星狀病毒(PAstV)首次由Bridger(1980)在3周齡的小豬腹瀉糞樣中電鏡觀察到，隨后在日本和南非有報道在小豬腹瀉糞樣中檢測到星狀病毒。有學者認為星狀病毒是引起豬腹瀉的原因之一。

經對現有技術的文獻檢索發現，Stanislav?Indik等在《Veterinary?Microbiology》(獸醫微生物)2006年第117期276～283頁發表了題為《Isolation?and?partialcharacterization?of?a?novel?porcine?astrovirus》(一株新型豬星狀病毒的分離和部分基因結構分析)一文，文中評述，目前的檢測豬星狀病毒含量的方法主要是聚合酶鏈反應(RT?PCR)、病毒分離(VI)。但是這些方法耗時長，而且存在容易交叉污染和操作過程繁瑣的缺點，檢測速度慢。Tapman實時熒光定量RT?PCR將PCR與熒光檢測相結合，克服了傳統PCR費時、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數量少等缺點，可以對樣品中病毒含量進行準確的定量檢測，具有簡單、易操作、結果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好等優點，已成為病原體檢驗的重要方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法。本發明的方法具有靈敏性高、穩定性高、可以定量，特異性好，假陽性低等特點。

本發明是通過以下的技術方案實現的，本發明的方法包括如下步驟：

步驟一，以豬星狀病毒基因的保守片段SEQ?ID?NO：1為靶目標，設計引物和探針，擴增基因片段；

步驟二，利用步驟一所得基因片段構建重組質粒；

步驟三，提取樣品的RNA，逆轉錄得到cDNA；

步驟四，按照常規熒光定量PCR檢測方法檢測樣品中的豬星狀病毒的含量。

步驟一和步驟四中，擴增時所使用的引物為：

上游引物：5’-TCCTTTTGTGGCTTTACTGTGAATG??-3’，

下游引物：5’-ATGAAGGCAGAAAGCAACTGATAAC??-3’。

步驟一和步驟四中，擴增時使用的探針為：

5’-(FAM)TGTACCAACCCAGCCAGAGAAGCT(TAMRA)-3’。

步驟二中，所述重組載體使用的質粒是pMD18-T。

步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，PCR單個循環為：95℃預變性3min；95℃變性10s，55℃退火40s，72℃延伸40s。

步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，共40個PCR單個循環。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：與RT-PCR相比，本發明的方法具有靈敏性高、穩定性高、可以定量，特異性好，假陽性低等特點；本發明的方法可以同時進行大量樣品的檢測，具有高通量性；與常規PCR相比，本發明的方法無需擴增后電泳分析，避免了PCR產物污染的風險；本熒光定量PCR檢測方法具有檢測范圍廣的特點，在10⁰～10⁷拷貝范圍內具有良好的線性關系，檢測范圍可以達到8個數量級。

附圖說明

圖1為實施例中豬星狀病毒絕對定量的標準曲線示意圖；

圖2為實施例中熒光定量PCR敏感性檢測的熒光信號圖；

圖3為實施例中熒光定量PCR特異性檢測的熒光信號圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆：實驗室手冊(New?York：Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例

步驟一，設計引物和Taqman探針