[發明專利]一步法病原體核酸熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200910309980.2
• 申請日: 2009-11-19
• 公開（公告）號: CN101713002A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發明（設計）人: 戴立忠;熊曉燕
• 申請（專利權）人: 戴立忠
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所 43205
• 代理人: 寧星耀

技術領域

本發明涉及一種核酸熒光定量PCR檢測方法，尤其是涉及一種一步法病原體核酸熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

血清中病毒核酸的提取，目前主要有四種方法：(1)直接煮沸法：向血清中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速離心，上清即為模板；其優點是易于操作；缺點是不能有效去除血清中抑制PCR的因素，弱陽性經常無擴增；(2)煮沸法：先將血清濃縮，再加裂解液，煮沸，高速離心，上清為模板，是目前國內臨床通用的方法；這種方法能部分去除撝苯又蠓蟹″中無法去除的抑制性因素，缺點在于濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無法看到，看得到沉淀的是因為將病毒與蛋白都濃縮了，這樣，導致后面加入裂解液時很難充分混勻；無法看到沉淀，使操作者無法確定吸棄上清時會不會吹打到病毒核酸；(3)柱提取法：血清通過裂解，過柱后核酸吸附到膜上，通過兩次洗滌，最后洗脫下來的為模板；這種方法相對前兩種提取方法而言，提取的核酸純度大大提高，不但可用于下游PCR實驗，還可用來做其他分子生物學實驗，缺點是手工操作過多，效率低，且無法自動化；(4)磁分離方法：磁分離是利用功能化磁性納米顆粒的表面配體(或受體)與受體(或配體)之間特異性相互作用來實現對靶向生物目標的快速分離；目前，磁分離方法已廣泛應用于核酸(DNA和RNA)、蛋白質、酶、細胞等多種生物物質的分離與純化；磁分離方法提取核酸可稱得上是提取核酸的終極方法，因為此方法具備上述所有方法的優點，并且能輕而易舉實現自動化。不過，所用試劑基本上為國外所壟斷，價格非常昂貴，從而限制了其在我國的廣泛應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種操作簡單快速，抗污染，干擾能力強，提取的核酸無損失，快速準確，所用試劑制造成本低的一步法病原體核酸熒光定量PCR檢測方法。

本發明的技術方案是：針對待測病原體核酸選取保守基因序列，設計特異性引物探針，采用一種核酸快速釋放試劑提取病原體核酸，直接加入相應的PCR反應液，實現PCR熒光定量檢測。

所述核酸快速釋放試劑由0.01～0.5mM/L(與KCl水溶液的質量體積比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl水溶液，0.01％～2％(與無菌水的質量體積比)的SDS(十二烷基磺酸鈉)、LLS(Lithium?lauryl?sulfate，十二烷基硫酸鋰)或Chelex-100(Chelex樹脂)，以及0.05％～1％(體積)的乙醇組成。

所述核酸快速釋放試劑配制方法：以無菌水、KCl配制50～200mM/L的KCl溶液，加入表面活性肽，使表面活性肽濃度達到0.01～0.5mM/L，加入0.01％～2％(與無菌水的質量體積比))的SDS、LLS或Chelex-100，加入0.05％～1％(體積)的乙醇，即配成本發明之核酸釋放試劑。

所述百分比以無菌水體積為計算基準(下同)。

本發明結果判斷：理想的標準品擴增曲線：基線平整，NTC無模板，不產生引物二聚體，一直是水平線；指數區較明顯，斜率大且固定；平臺區匯于一起，線性范圍廣。理想的標準曲線：斜率接近于-3.322，一致性系數接近1.000，理想的重復性，同一樣本CT值變異系數＜10％，濃度變異系數＜50％。

本發明優點：整個樣本處理和檢驗過程在一個PCR反應管中即可完成，無需離心、振蕩、更換離心管等一系列繁瑣操作，不但簡化了操作步驟，節省了耗材成本，而且無需加熱，開/關管蓋，移液等可能導致核酸丟失與污染的操作，抗污染能力強，實驗結果的重復性大大提高，對操作人員的技術要求較低；還節省了時間成本，可以讓臨床醫生及患者及早得到診斷結果，避免等待試驗結果的焦慮。

總之，本發明一步法實現PCR熒光定量檢測，操作簡單快速，抗污染抗干擾能力強，提取的核酸無損失，所用試劑制造成本低。

附圖說明

圖1(a)為本發明方法檢測HBV?DNA標準品的熒光定量PCR擴增曲線；

圖1(b)為本發明方法檢測HBV?DNA標準品所作標準曲線；

圖2(a)為對照方法(離心柱法)提取HCV?RNA并進行熒光定量PCR檢測擴增曲線；

圖2(b)為本發明方法重復性檢測HCV?RNA陽性樣本的熒光定量PCR擴增曲線；

圖3為本發明方法檢測沙眼衣原體(CT)陽性樣本的熒光定量PCR擴增曲線。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明作進一步說明。

實施例1用于HBV?DNA的熒光定量PCR檢測