[發(fā)明專利]一種復(fù)合脂肪顆粒及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910309940.8
• 申請(qǐng)日: 2009-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102058905A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田衛(wèi)東;郭麗娟;湯煒;王杭;龍潔;劉磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): A61L27/38
• 分類號(hào): A61L27/38;A61L27/54
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 劉明芳;吳彥峰

1.一種復(fù)合脂肪顆粒，由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞、脂肪顆粒按照下述比例組成：

2ml富含血小板血漿∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107個(gè)脂肪干細(xì)胞∶4ml脂肪顆粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合脂肪顆粒，其特征在于：所述的富含血小板血中，血小板濃度為(1300.00±400.00)×109/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合脂肪顆粒，其特征在于：所述的人凝血酶溶液的組分比例為：

1ml蒸餾水∶0.1g氯化鈣∶800～1200單位人凝血酶凍干粉。

4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合脂肪顆粒的制備方法，包括下述主要步驟：

(1)、制備富含血小板血漿：

抽取抗凝全血，通過(guò)兩次離心法得到富含血小板血漿；

(2)、制備人凝血酶溶液：

按照1ml蒸餾水∶0.1g氯化鈣∶800～1200單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝血酶凍干粉置于無(wú)菌的10％氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液；

(3)、分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞：

在無(wú)菌條件下抽取脂肪，采用組織塊培養(yǎng)法或消化培養(yǎng)法分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞；

(4)、制備脂肪顆粒：

在無(wú)菌條件下抽取脂肪，去除血液、水分、油脂，得到純凈的脂肪顆粒；

(5)、混合、制得復(fù)合脂肪顆粒：

將上述各步驟制得的富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞、脂肪顆粒按照2ml∶1ml∶(2±0.5)×107個(gè)∶4ml的比例充分混合均勻，即得到本發(fā)明所述的復(fù)合脂肪顆粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述的步驟(1)制備富含血小板血漿的方法如下：

用預(yù)先裝有0.5ml?3.8％枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4.5ml全血，搖勻，移入離心管中，進(jìn)行兩次離心：第一次離心速度為1000r/min，時(shí)間為15分鐘，離心后血液分為三層：最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細(xì)胞、最下層為紅細(xì)胞層；棄去最下層的紅細(xì)胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進(jìn)行二次離心，速度為2000r/min，時(shí)間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，將剩余液體搖勻，即得。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述的步驟(3)分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法如下：

在無(wú)菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后2h內(nèi)在超凈工作臺(tái)中，用2倍體積的PBS緩沖液沖洗至少3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的1％I型膠原酶，混勻后于37℃恒溫?fù)u床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表面漂浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質(zhì)接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入α-MEM培養(yǎng)基，置入37oC、飽和濕度、5％CO2的孵箱中培養(yǎng)，3天后加2ml培養(yǎng)基，7天后換培養(yǎng)基，清除未貼壁的細(xì)胞及組織塊，原代細(xì)胞培養(yǎng)15～20d即可融合；細(xì)胞長(zhǎng)滿80％時(shí)，用0.25％胰酶消化、傳代；傳代細(xì)胞繼續(xù)加入α-MEM培養(yǎng)基，置入37oC、飽和濕度、5％CO2的孵箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60％時(shí)，以0.25％胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細(xì)胞，即得。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述的步驟(4)制備脂肪顆粒的方法如下：

在無(wú)菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗至少3次，去除血液、水分、油脂，通過(guò)1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心2分鐘，進(jìn)一步去除血液、水分、油脂，即得。