[發明專利]從家蠅幼蟲中誘導并提取金屬硫蛋白的方法

無效

• 申請號: 200910308720.3
• 申請日: 2009-10-24
• 公開（公告）號: CN101696241A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 孟慶煜
• 申請（專利權）人: 孟慶煜
• 主分類號: C07K14/825
• 分類號: C07K14/825;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16
• 代理公司: 大慶市遠東專利商標事務所 23202
• 代理人: 周英華

技術領域

本發明涉及一種物質提取方法，尤其是從家蠅幼蟲中誘導并提取金屬硫蛋白的方法。

背景技術

金屬硫蛋白是一種分子量約為6000-8000Da的金屬結合蛋白，富含半胱氨酸。金屬硫蛋白廣布于原核與真核的生物體內，具有參與稀有元素轉運、貯存與代謝，以及重金屬解毒和清除自由基等作用。該蛋白已被人們用于改善消化道微環境、治療胃潰瘍和配制化妝品等方面。金屬硫蛋白的提取以及純化方法很多，包括層析法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等，但是多數只能用于實驗室研究，不適于在工業生產中采用。并且目前金屬硫蛋白的提取多數是從酵母菌、蝸牛及兔肝內提取硫蛋白，由于供體有限且成本高，不利于長期經濟的發展，且現有提取方法的提取量較小、純度較低。

發明內容

針對現有金屬硫蛋白提取方法提取純度低、提取量小等不足，本發明提供一種誘導并提取金屬硫蛋白的方法，從家蠅幼蟲中提取，降低了成本。在原有粗品的生產工藝基礎上采用進一步離子交換層析和脫鹽，研究了精品的生產工藝，同時對誘導次數以及采用生理鹽水作為誘導劑進行了研究，提高金屬硫蛋白的提取量及提取純度。

本發明的從家蠅幼蟲中誘導并提取金屬硫蛋白的方法，其操作步驟如下：

a、以麥麩、水、10％EM復合菌群和含有鋅、銅、鉻復合離子誘導劑為原料，常溫發酵10～50小時制成培養基；

b、取家蠅的卵植入a步驟制得的培養基內，溫度控制在30～35攝氏度，二十四小時后在培養基表面均勻噴灑5％濃度的相當于培養基總量10％的Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺金屬離子誘導劑，培養4～6天，即制得家蠅幼蟲蛋白原料；

c、取經b步驟培養的幼蟲在4～20攝氏度純凈水中漂洗2次，再放入20～50攝氏度、10％過氧化氫溶液浸泡10～120分鐘；

d、將經c步驟處理的幼蟲在無菌水中漂洗30分鐘，置于離心干燥機中干燥3～20分鐘，取出置于-30～-70攝氏度下冷凍保存；

e、取經d步驟處理的家蠅幼蟲蛋白原料投入到高速均漿機中，按照投入原料的1∶1添加常溫甘氨酸緩沖液制成均漿液，甘氨酸緩沖液的PH值7～9；濃度0.1～2mol/L；

f、再將e步驟得到的混合液進行0.1～0.45靘濾膜過濾，濾液濃度為1～10g/mL，膜過濾蛋白分子量12000～15000Da溶液；

g、將經f步驟制得的溶液進行模擬移動床色譜分離，洗脫泵流量0～1000mL/min，壓力0～10Mpa；進樣泵流量0～30mL/min，壓力0～8Mpa；萃取泵流量0～100mL/min，壓力0～10MPa；工作溫度20～25攝氏度；模擬移動床色譜參數：解吸段4根柱、精制段4根柱、吸附段4根柱，進樣流速Uf＝8～12mL/min，洗脫泵流速Ud＝340～380mL/min，萃取液流速Ue＝230～250mL/min，殘余液流速Ur＝118～142mL/min，切換時間ts＝14～18min；

h、將經g步驟處理的殘余液蛋白分子量5500～6500Da，注入真空濃縮罐內，經減壓濃縮含水1～50％后，再進行真空凍干機凍干20小時，即制成金屬硫蛋白產品。

作為本發明的進一步改進，上述色譜柱填料及流動相選擇填料為反相硅膠ODS，填料粒度30～40um，洗脫流動相為乙醇與水的混合物，乙醇和水的體積比為5∶5。

本發明從家蠅幼蟲中誘導提取金屬硫蛋白的方法，簡單易行，成本低、提取純度高、提取量大。

具體實施方式

本發明從家蠅幼蟲中誘導并提取金屬硫蛋白的方法，其操作步驟如下：

a、以麥麩、水、10％EM復合菌群和含有鋅、銅、鉻復合離子誘導劑為原料，常溫發酵10～50小時制成培養基；

b、取家蠅的卵植入a步驟制得的培養基內，溫度控制在30～35攝氏度，二十四小時后在培養基表面均勻噴灑5％濃度的相當于培養基總量10％的Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺金屬離子誘導劑，培養4～6天，即制得家蠅幼蟲蛋白原料；

c、取經b步驟培養的幼蟲在4～20攝氏度純凈水中漂洗2次，再放入20～50攝氏度、10％過氧化氫溶液浸泡10～120分鐘；

d、將經c步驟處理的幼蟲在無菌水中漂洗30分鐘，置于離心干燥機中干燥3～20分鐘，取出置于-30～-70攝氏度下冷凍保存；