[發(fā)明專利]用膠體金免疫層析試驗檢測伏馬毒素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910307796.4
• 申請日: 2009-09-27
• 公開（公告）號: CN101661043A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發(fā)明（設計）人: 嚴亞賢;王君;王元凱;孫建和
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發(fā)明涉及一種生物檢測工程技術領域的方法，具體是一種用膠體金免疫層析試驗檢測伏馬毒素的方法。

背景技術

伏馬毒素(Fumonisins)是串珠鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產生的次級代謝產物，在全世界范圍內分布廣泛。1988年，Gelderblom等首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬毒素。伏馬毒素能夠對玉米及其制品造成污染，而且在以谷物為原料的一些產品中如面條、啤酒、調味品，甚至在蘆筍中也檢測到了伏馬毒素。據報道，伏馬毒素與馬腦白質軟化癥，豬的肺水腫癥候群，大鼠肝癌等疾病有關。除上述疾病外，在南非的特蘭斯凱地區(qū)和中國林縣地區(qū)研究發(fā)現，食用伏馬毒素污染的玉米制品與人類食道癌相關。串珠鐮刀菌產生的毒素已經被國際癌癥研究會(International?Agency?for?Research?on?Cancer，IARC)劃分到2B類--可能的人類致癌物。加入WTO之后，農產品及相關食品的國際貿易量日益增加，隨之對進出口產品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關、生產企業(yè)、監(jiān)督部門等部門迫切需要一種特異、快速、簡便的伏馬毒素檢測方法。

膠體金免疫層析試驗的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的膠體金標記。固定在NC膜上的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，膠體金標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又有示蹤的功能。在測定時，通常受檢樣品(測定其中的抗體或抗原)通過毛細作用向前移行與金標墊上的抗原或抗體起反應。繼續(xù)向前移行，與固定在T線(檢測線)抗原或抗體結合形成免疫復合物被截留而顯色，約為一條寬為1mm的棕紅色條帶，多余的金標抗體繼續(xù)向前移動，與固定在C線(質控線)的二抗結合被截留而顯色，約為一條寬為1mm的棕紅色條帶。此時T線形成金標復合物與標本中受檢物質的量呈一定的比例，故可根據T線呈現的顏色深淺進行定性或半定量分析。

關于伏馬毒素的檢測國內外已建立了多種方法。目前檢測伏馬毒素的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，在全球范圍內的玉米及其制品的調查中，90％以上的實驗室用的都是HPLC法。由于伏馬毒素本身既沒有特異的紫外吸收基團，同時也沒有熒光特性，但在一定條件下伏馬毒素可同某些物質反應形成具有熒光的衍生物，因此熒光衍生劑和衍生方法的選擇與HPLC檢測伏馬毒素的準確度和靈敏性有密切關系。此外該法需要對檢測樣品進行嚴格的預處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時要求有專業(yè)的操作人員，不利于現場常規(guī)檢測使用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種用膠體金免疫層析試驗快速檢測伏馬毒素的方法。本發(fā)明的方法檢測特異性強，準確率高；檢測速度快，所需時間短，只需5～10分鐘。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現的，本發(fā)明包括具體步驟如下：

步驟一，將伏馬毒素半抗原通過戊二醛法分別與KLH(血藍蛋白)和OVA(卵清白蛋白)偶聯；

步驟二，利用步驟一所得伏馬毒素-KLH偶聯物，采用常規(guī)方法制備抗伏馬毒素的單克隆抗體；

步驟三，用檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，用該膠體金標記經過透析除鹽處理的抗伏馬毒素的單克隆抗體；

步驟四，將步驟三得到的單克隆抗體蛋白噴涂到金標墊上，將伏馬毒素-OVA偶聯物噴涂到T線，兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到C線，組裝成試紙條，干燥；

步驟五，將待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，將上清滴入試紙條的樣本槽中，獲取T線和C線的顯色，鑒定，得到結果。

步驟三中，所述膠體金的制備方法具體為：將100ml的0.005％HAuCl₄溶液加熱至沸騰，之后加入0.5～1ml的1％檸檬酸三鈉水溶液，煮沸7～10min，最后加三蒸水至100ml，制備得到40nm的膠體金溶液；其中，百分數為重量體積百分數。

步驟三中，所述標記具體為：在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入單克隆抗體，使其終濃度達到40ug/mL，25℃下孵育5min，用0.1mol/L?K₂CO₃調節(jié)膠體金溶液的pH為9.0，然后加入10％BSA至BSA的終濃度為0.1％，10000rpm離心20min，棄上清，再用0.01mM?pH為9.0的Tris緩沖液恢復，重復1次，之后將沉淀重懸于原體積的1/10的0.01mM?pH為9.0的Tris緩沖液中，最后加入10％BSA至BSA的終濃度為0.1％，4℃儲存?zhèn)溆茫黄渲校俜謹禐橹亓矿w積百分數。

步驟四中，所述干燥為37℃烘箱干燥。