[發明專利]一種提取超氧化物歧化酶的方法

無效

• 申請號: 200910306090.6
• 申請日: 2009-08-26
• 公開（公告）號: CN101629167A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發明（設計）人: 謝無畏;陳放;歐陽超;唐琳;徐鶯;王勝華
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉雪蓮;吳彥峰

技術領域

本發明涉及一種提取超氧化物歧化酶的方法，尤其涉及一種從麻瘋樹中提取超氧化物歧化酶的方法。

背景技術

超氧化物歧化酶(Superoxide?dismutase，簡稱SOD)是一類普遍存在于動物、植物及微生物中的一種金屬酶。依據活性位點結合金屬離子的不同，超氧化物歧化酶可分為CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD四種。超氧化物歧化酶是生物體內特異清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶，能催化超氧陰離子自由基歧化成分子氧和過氧化氫，從而減輕氧自由基對機體的危害。

氧自由基與大部分疾病以及機體的衰老有關。自由基的大量積累能引起蛋白質變性和交聯，使體內的許多酶及激素失去生物活性，機體的免疫能力、神經反射能力、運動能力等系統活力降低，同時還能破壞核酸結構和導致整個機體代謝失常等，最終使機體發生病變。超氧化物歧化酶是生物體細胞中最主要的抗氧化酶，它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害。將生物體內多余的并對細胞破壞力極強的超氧陰離子自由基通過歧化反應而生成過氧化氫和氧氣，過氧化氫隨后被體內的抗壞血酸和過氧化氫酶(CAT)分解為H₂O和O₂，從而解除O₂^-所造成的氧化脅迫。這在維持生物體內超氧陰離子自由基的產生與消除的動態平衡中起著重要作用。因此，超氧化物歧化酶在醫藥、化妝品和食品等領域均有廣泛的應用。在臨床上，超氧化物歧化酶可用于延緩衰老、消炎、防輻射、防治腫瘤、癌癥等；在化妝品應用中，超氧化物歧化酶具有祛斑、抗皺、抗炎、防止皮膚衰老的功能；在食品工業中，超氧化物歧化酶可作為功效因子或食品營養強化劑應用，目前已有超氧化物歧化酶牛奶、飲料、罐頭、啤酒等多種功能食品面市。

超氧化物歧化酶的分離純化有兩種途徑，一種是從生物原材料中直接分離得到純品，另一種是通過基因工程和發酵工程的方法得到基因重組的蛋白。目前市場上的超氧化物歧化酶產品大部分是從生物原材料中直接分離獲得，特別是從動物血液中提取的。隨著世界各地瘋牛病、禽流感、口啼疫等惡性傳染病不時報道，生產動物源血液制品的風險加大，致使超氧化物歧化酶的提取由于原材料有限，存在產量少、難以滿足市場需要的問題。并且現有的提取超氧化物歧化酶的方法工藝步驟復雜，酶的比活與純度難以達到綜合平衡。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提取超氧化物歧化酶的方法，它以麻瘋樹種子為原料，可兼顧酶的比活和回收率，有利于企業大規模生產。

為了實現上述發明目的，本發明人經過反復試驗，提供了以下技術方案：

一種超氧化物歧化酶的提取方法，它是用麻瘋樹種子或葉片為原料提取得到的。

所述的超氧化物歧化酶的提取方法的具體步驟是：

(1)、粗酶液的制備：

將麻瘋樹種子或葉片洗凈，加入pH值為7.8、濃度為0.05mol/L、內含1mmol/L?EDTA的磷酸鹽緩沖液，所述麻瘋樹種子與磷酸鹽緩沖液的重量體積比為100∶70～80(g/ml)，勻漿，過濾，收集濾液，離心得上清液，即為粗酶液；

(2)、除雜蛋白：

將粗酶液于55℃水浴中熱變性處理25min，于4℃下6000r/min離心20min，去沉淀，在上清液中加入0.1mol/L鹽酸調節溶液pH至5.0，在4℃下6000r/min離心20min，收集上清液；

(3)、硫酸銨分段鹽析：

在步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨粉末，至溶液飽和度為45％，攪拌30min，靜置2h，在4℃下6000r/min離心20min，去除沉淀，于上清液中加入硫酸銨粉末至溶液飽和度為90％，攪拌30min，于4℃下靜置過夜，次日取出，在4℃下6000r/min離心40min，棄上清，將沉淀溶解于pH值為7.8、濃度為0.05mol/L、內含1mmol/L?EDTA的磷酸鹽緩沖液中，將溶解所得酶液裝入透析袋內，于4℃透析過夜，直至酶液中無硫酸根離子檢出；

(4)、丙酮沉淀：向步驟(3)所得酶液中加入等體積的4℃冷丙酮，于4℃自然沉淀60min，在4℃下6000r/min離心40min，棄上清，用蒸餾水稀釋沉淀，裝入透析袋內，用pH值為7.8、濃度為0.05mol/L、內含1mmol/L?EDTA的磷酸鹽緩沖液透析平衡，收集酶活性部分即得超氧化物歧化酶液。

所得超氧化物歧化酶液經冷凍干燥后即得超氧化物歧化酶干粉，可用于各種商業用途。

所述步驟(1)中離心得上清液的具體方法為：