[發明專利]一種提取超氧化物歧化酶的方法

無效

• 申請號: 200910306090.6
• 申請日: 2009-08-26
• 公開（公告）號: CN101629167A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發明（設計）人: 謝無畏;陳放;歐陽超;唐琳;徐鶯;王勝華
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉雪蓮;吳彥峰

1.一種提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于它是用麻瘋樹種子或葉片為原料提取得到的，具體步驟是：

（1）、粗酶液的制備：

將麻瘋樹種子或葉片洗凈，加入pH值為7.8、濃度為0.05mol/L、內含1mmol/L?EDTA的磷酸鹽緩沖液，所述麻瘋樹種子與磷酸鹽緩沖液的重量體積比為100：70～80（g/ml），勻漿，過濾，收集濾液，離心得上清液，即為粗酶液；

（2）、除雜蛋白：

將粗酶液于55℃水浴中熱變性處理25min，于4℃下6000r/min?離心20min，去沉淀，在上清液中加入0.1?mol/L鹽酸調節溶液pH?至5.0，在4℃下6000r/min?離心20min，收集上清液；

（3）、硫酸銨分段鹽析：

在步驟（2）所得上清液中加入硫酸銨粉末，至溶液飽和度為45%，攪拌30min，靜置2h，在4℃下6000r/min?離心20min，去除沉淀，于上清液中加入硫酸銨粉末至溶液飽和度為90%，攪拌30min，于4℃下靜置過夜，次日取出，在4℃下6000r/min?離心40min，棄上清，將沉淀溶解于pH值為7.8、濃度為0.05mol/L、內含1mmol/L?EDTA的磷酸鹽緩沖液中，將溶解所得酶液裝入透析袋內，于4℃透析過夜，直至酶液中無硫酸根離子檢出；

（4）、丙酮沉淀：向步驟（3）所得酶液中加入等體積的4℃冷丙酮，于4℃自然沉淀60min?，在4℃下6000r/min?離心40min，棄上清，用蒸餾水稀釋沉淀，裝入透析袋內，用pH值為7.8、濃度為0.05mol/L、內含1mmol/L?EDTA的磷酸鹽緩沖液透析平衡，收集酶活性部分即得超氧化物歧化酶液。

2.根據權利要求1所述的提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述步驟（1）中離心得上清液的具體方法為：

將收集的濾液，在4℃下6000r/min?離心40min,使懸浮物完全沉淀,取上清保存待用，沉淀再加入磷酸鹽緩沖液,?充分溶解，再次在4℃下6000r/min?離心40min，棄去沉淀,合并兩次上清液,即為粗酶液。

3.根據權利要求1或2所述的提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于丙酮沉淀步驟后還包括以下步驟：Sephadex?G2100?分子篩柱層析：將步驟（4）所得酶液加入Sephadex?G2100?分子篩層析柱中,用pH值為7.8、濃度為0.05mol/L、內含1mmol/L?EDTA的磷酸鹽緩沖液洗脫,?洗脫速度控制在4?mL/10?min，收集活性峰，于4℃透析后即得超氧化物歧化酶液。