[發明專利]一種用于核酸擴增的環形引物及其應用

有效

• 申請號: 200910301170.2
• 申請日: 2009-03-27
• 公開（公告）號: CN101671674A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 阮力;何東華;鄭立謀;陳琰
• 申請（專利權）人: 廈門艾德生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明涉及聚合酶鏈式反應(PCR)中所用的核酸擴增引物的設計與應用技術，特別是涉及應用在實時PCR反應中，尤其是在突變檢測和稀有突變檢測中的應用。

背景技術

聚合酶鏈式反應(PCR)技術是一種簡單快捷、高靈敏、特異的基因擴增方法，其過程通常包括20-50個由變性、退火和延伸三步反應構成的循環。可以在1.5-3小時內特異地擴增靶核酸序列至幾百萬倍。近年來，由于實時PCR儀的出現使普通PCR不再需要凝膠電泳分析，從而不必PCR后操作，杜絕了PCR污染。因此實時PCR技術在臨床上應用越來越廣泛。實時熒光PCR檢測技術最早使用熒光染料，例如SYBR?GREEN，EVE-GREEN，以指示PCR反應。隨后，實時熒光PCR檢測技術中開始應用標記熒光的核酸探針，例如5’-核酸外切酶技術中使用的Taqman探針、分子信標、熒光能量轉移探針(相鄰探針)、蝎子引物、點亮探針等。染料法盡管簡單，然而其無法識別非特異擴增，尤其是由于引物二聚體引起的非特擴增，因此在實際應用中受到很大限制。探針法對擴增產物具有第二識別步驟，從而避免了非特異擴增，結果更加可靠。不過，探針普遍存在設計復雜，合成成本高等缺點。這兩類方法缺點的根源都在于它們不能有效防止非特異擴增。

稀有突變是指大量野生型基因背景下的極少的突變基因，特別是單堿基突變的基因。一般突變基因與野生型基因的比率小于1/1000。例如孕婦外周循環血中含有的微量胎兒突變基因，腫瘤病人血液中或腫瘤組織內含有的少量腫瘤體細胞突變。能否準確檢測這類稀有突變對現有檢測技術提出了挑戰。

PCR方法用于突變檢測的關鍵是根據目標基因順序設計一對具有高嚴謹性的、與目標基因DNA或RNA互補的引物。擴增阻礙突變系統(Amplification?Regractory?MutationSystem，ARMS)技術于1989年建立，又稱等位基因特異性PCR(Allele-specific?PCR，AS-PCR)，也叫序列特異性引物PCR(PCR?with?Sequence?Specific?Primers，PCR-SSP)。在眾多突變檢測方法中應用最為廣泛。其基本構思是設計2條ARMS上游引物，共用1條下游引物構成PCR反應體系。等位基因特異性堿基置于引物3’末端，這是因為耐熱Taq?DNA聚合酶缺乏3’-5’外切校正活性，在PCR反應進行時，位于引物3’末端的特異性堿基分別結合于野生型和突變型等位基因的位點，若此堿基對形成錯配，DNA鏈延伸反應就會因為3’-5’-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻。但是ARMS引物3’末端堿基對不同錯配區分能力不同，因此對有些突變的區分能力有限。

發明概要

本發明涉及使用一種用于核酸PCR擴增的新式引物。該引物在設計思路上與前述的當前引物根本不同，通過巧妙的設計將引物的特異性大大提高。此引物特異性高、不形成引物二聚體、設計簡單、易于合成，適合基因表達量的檢測、SNP檢測以及稀有突變檢測。

本發明的引物包括兩種，一種是單擴增環形引物，可以用于基因的普通擴增；另一種是具有雙擴增功能的環形引物，特別適合突變檢測系統，尤其是稀有突變檢測體系。

本發明中涉及的單擴增環形引物技術是基于對靶核酸的直接雜交，該引物由于5端具有與引物3端互補的序列，可以形成一個環形結構，環形結構易于打開，因此對靶序列的擴增效率不受影響。針對突變序列的堿基可以是在引物3末端也可以在引物內部，成環序列的多少可以根據序列不同而進行調整，從而可以調整引物對突變序列識別的特異性。

本發明中的雙擴增環形引物在引物內部引入一端通用標簽序列，標簽序列和環形引物按一定比例(標簽序列一般為環形引物用量的10倍以上)，同時加入PCR擴增體系，在PCR循環的前2個循環，環形引物高特異地識別突變靶序列并進行初期擴增，從第3個循環開始，由于大量存在標簽引物，標簽引物大量擴增把初期積累的特異PCR產物急速擴增和放大，從而保持對稀有突變靶序列的極高特異性和極高靈敏度。

根據此，本發明的環形引物可以被用于實時PCR中靶核酸的檢測。

本發明的探針所使用的核苷酸可以是DNA，RNA，LNA，或PNA，或任何非自然核苷組成。

本發明還涉及到環形引物技術的應用。