[發明專利]一種用于核酸擴增的環形引物及其應用

有效

• 申請號: 200910301170.2
• 申請日: 2009-03-27
• 公開（公告）號: CN101671674A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 阮力;何東華;鄭立謀;陳琰
• 申請（專利權）人: 廈門艾德生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司
• 代理人: 張松亭

1.一種用于核酸擴增的環形引物，該引物為一條寡核苷酸，其特征在于：該寡核苷酸的3’端為與靶序列互補的靶序列識別區，5’端為與靶序列識別區互補的3-20個堿基，在合適條件下，5’端和3’端可以相互結合為雙鏈，使引物形成一個環狀結構；當引物與靶序列識別并雜交時，雙鏈結構被打開，環形結構消失，引物從自身雙鏈變為與靶序列結合的雙鏈而獲得DNA延伸能力。

2、如權利要求1所述的一種用于核酸擴增的環形引物，其特征在于：所述的環形引物進一步包括一個突變識別區。

3、如權利要求2所述的一種用于核酸擴增的環形引物，其特征在于：所述的突變識別區位于靶序列識別區的3’末端或靶序列識別區內部。

4、一種擴增核酸的方法，采用上游引物F及下游引物R，其特征在于：其中至少有一條引物為環形引物，該環形引物的3’端為與靶序列互補的靶序列識別區，5’端為與靶序列識別區互補的3-20個堿基，在合適條件下，5’端和3’端可以相互結合為雙鏈，使引物形成一個環狀結構；當環形引物與靶序列識別并雜交時，雙鏈結構被打開，環形結構消失，引物從自身雙鏈變為與靶序列結合的雙鏈而獲得DNA延伸能力。

5、如權利要求4所述的一種擴增核酸的方法，其特征在于：所述的環形引物進一步含有一個突變識別區。

6、如權利要求5所述的一種擴增核酸的方法，其特征在于：所述的突變識別區位于靶序列識別區的3’末端或靶序列識別區內部。

7、一種用于核酸擴增的環形引物，該引物為一條寡核苷酸，其特征在于：該寡核苷酸的3’端為與靶序列互補的靶序列識別區，5’端為與靶序列識別區互補的3-20個堿基，在合適條件下，5’端和3’端可以相互結合為雙鏈，使引物形成一個環狀結構；

引物內部帶有一個通用標簽序列，在合適條件下，引物的3’端形成雙鏈，引物內部形成一個環形結構，當引物與靶序列識別并雜交時，雙鏈結構被打開，環形結構消失，引物從自身雙鏈變為與靶序列結合的雙鏈而獲得DNA延伸能力。

8、如權利要求7所述的一種用于核酸擴增的環形引物，其特征在于：所述的環形引物的進一步包括一個突變識別區。

9、如權利要求8所述的一種用于核酸擴增的環形引物，其特征在于：所述的突變識別區位于靶序列識別區的3’末端或靶序列識別區內部。

10、如權利要求7所述的一種用于核酸擴增的環形引物，其特征在于：引物總長度為35-80bp，靶序列結合區16-40bp，通用標簽序列16-30bp。

11、一種采用環形引物擴增的方法，其特征在于：體系中含有三條引物，分別為上游引物F、下游引物R、通用引物T，其中：

上游引物F和下游引物R中至少有一條為環形引物，該環形引物的3’端為與靶序列互補的靶序列識別區，5’端為與靶序列識別區互補的3-20個堿基，在合適條件下，5’端和3’端可以相互結合為雙鏈，使引物形成一個環狀結構；

上游引物F和下游引物R內部各帶有一個相同的通用標簽序列；

在合適條件下，環形引物的3’端與自身的互補序列形成雙鏈，引物內部形成一個環形結構，當引物與靶序列識別并雜交時，雙鏈結構被打開，環形結構消失，引物從自身雙鏈變為與靶序列結合的雙鏈而獲得DNA延伸能力；

通用引物T的序列與上下游引物F、R中的標簽序列完全相同。

12、如權利要求11所述的一種采用環形引物擴增的方法，其特征在于：所述的環形引物中進一步包括一個突變識別區。

13、如權利要求12所述的一種采用環形引物擴增的方法，其特征在于：所述的突變識別區位于靶序列識別區的3’末端或靶序列識別區內部。

14、如權利要求11所述的一種采用環形引物擴增的方法，其特征在于：環形引物總長度為35-80bp，靶序列結合區16-40bp，通用標簽序列16-30bp。

15、如權利要求11所述的一種采用環形引物擴增的方法，其特征在于：標簽序列T的添加量為引物F及R總添加量的10倍以上。

16、如權利要求11所述的一種采用環形引物擴增的方法，其特征在于：擴增包含以下幾個部分：1）預變性；2）包括變性、引物退火和引物延伸循環的第一部分PCR擴增；3）包括變性、引物退火和引物延伸循環的第二部分PCR擴增，其中：

步驟2）擴增的退火溫度為60～66℃；

步驟3）擴增的退火溫度為54～58℃。