[發(fā)明專利]無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法和制備疫苗的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910265983.0
• 申請日: 2009-12-31
• 公開（公告）號: CN102115729A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張韌;陳文慶;王建超
• 申請（專利權(quán)）人: 北京清大天一科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K39/205;A61K39/135;A61P31/14;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京銀龍知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法以及制備疫苗的方法，尤其是一種無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法以及包括所述培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法的制備疫苗的方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法中，一般通過增加大豆水解產(chǎn)物作為無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基的組分，來提高被培養(yǎng)BHK21細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定性和培養(yǎng)密度、增加被培養(yǎng)BHK21細(xì)胞產(chǎn)量及利用BHK21細(xì)胞作為表達載體后所產(chǎn)生重組靶蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)量。并且認(rèn)為其它植物的水解產(chǎn)物，例如小麥水解產(chǎn)物不能得到與大豆水解產(chǎn)物相當(dāng)?shù)挠幸嫘Ч?/p>

例如CN?1318577C(專利號00816020.1)中公開了一種培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方法，該方法使用了無蛋白無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述大豆水解產(chǎn)物的分子量≤500道爾頓。該培養(yǎng)基能夠起到提高被培養(yǎng)重組細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定性、終細(xì)胞密度以及重組細(xì)胞靶蛋白產(chǎn)率的作用。WO?02/29084也在說明書實施例中提及可以向培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加大豆蛋白的水解產(chǎn)物。

但是大豆水解產(chǎn)物中除了含有大豆蛋白外還含有許多其他成分，比如，大豆油、大豆多糖、大豆皂甙等，因此在向無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基中添加大豆水解產(chǎn)物的同時，極有可能加入上述其他成分即加入雜質(zhì)成分，從而不利于細(xì)胞的增殖和生長。此外，由于大豆蛋白在不同水解條件下被水解程度不同，因而得到的大豆蛋白水解產(chǎn)物成分很難統(tǒng)一，會造成培養(yǎng)基成分不確定，從而使被培養(yǎng)細(xì)胞的批次差異性大，且使被培養(yǎng)細(xì)胞的下游產(chǎn)品分離困難。

綜上，雖然現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)了使用添加大豆水解產(chǎn)物的無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法，但目前這類動物細(xì)胞培養(yǎng)方法仍然存在細(xì)胞培養(yǎng)密度低、分離細(xì)胞下游產(chǎn)品成本高、被培養(yǎng)細(xì)胞的批次差異性大、安全性差的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法存在細(xì)胞培養(yǎng)密度低、分離細(xì)胞下游產(chǎn)品成本高、被培養(yǎng)細(xì)胞的批次差異性大、安全差的缺點，提供一種新的無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法，該方法的細(xì)胞培養(yǎng)密度高、利于分離細(xì)胞下游產(chǎn)品、成本低、被培養(yǎng)細(xì)胞的批次差異性小、安全性好。

本發(fā)明的第二個目的是提供包括所述培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法的制備狂犬病疫苗的方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供包括所述培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法的制備口蹄疫疫苗的方法。

現(xiàn)有技術(shù)公開的無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法揭示，向無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中加入除大豆水解蛋白外的其他蛋白效果不好，例如，在CN?1318577C的說明書第3-4頁明確記載，“與現(xiàn)有技術(shù)已知的其它水解產(chǎn)物(例如小麥水解產(chǎn)物、水稻水解產(chǎn)物或酵母水解產(chǎn)物)相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅大豆水解產(chǎn)物介導(dǎo)按照本發(fā)明的特性，并且導(dǎo)致例如顯著提高重組靶蛋白的得率。”在該文件的實施例7中揭示出小麥水解產(chǎn)物不如大豆蛋白水解產(chǎn)物效果好。

然而本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，向無血清基本培養(yǎng)基中以培養(yǎng)基溶劑的體積為基準(zhǔn)，加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0-200g/100L的小麥麩蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白，用于無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)敘利亞地鼠腎細(xì)胞(BHK21細(xì)胞)時，能夠達到的細(xì)胞培養(yǎng)密度遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)添加大豆水解產(chǎn)物或大豆蛋白水解產(chǎn)物的無血清培養(yǎng)方法所能達到的細(xì)胞培養(yǎng)密度；由于添加的成分確定，一方面有利于分離細(xì)胞下游產(chǎn)品，使成本降低，另一方面使被培養(yǎng)細(xì)胞的批次差異性大大減小，安全性更好。

本發(fā)明提供了一種無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法，該方法包括將BHK21細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基，并且以所述培養(yǎng)基溶劑的體積為基準(zhǔn)，所述培養(yǎng)基還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0-200g/100L的小麥麩蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。

本發(fā)明還提供了一種制備疫苗的方法，所述方法包括培養(yǎng)作為病毒宿主的BHK21細(xì)胞的步驟，其中，所述培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的步驟按照本發(fā)明所述無血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞的方法進行。