[發(fā)明專利]一株高產(chǎn)耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母及其構(gòu)建

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910264850.1
• 申請日: 2009-12-24
• 公開（公告）號: CN101899458A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李崎;李永仙;鄭飛云;劉春鳳;顧國賢;秦久福
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84;C12R1/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在啤酒工業(yè)中，啤酒廠在糖化過程中使用β-葡聚糖酶已經(jīng)比較普遍，國外許多公司如NOVO、諾維信、DMS等早已有商品化的酶制劑出售。在糖化過程中，大麥胚乳細(xì)胞壁中的β-葡聚糖雖然在制麥階段大部分被降解，但因植物β-葡聚糖酶耐溫性差，在糖化時其剩余活力會被完全破壞，殘留的β-葡聚糖仍有可能會導(dǎo)致麥汁粘度過大，致使過濾困難，延長糖化醪過濾時間，降低浸出物含量。在發(fā)酵過程中，過量的β-葡聚糖會導(dǎo)致酵母早期沉降，降低發(fā)酵度。在成品啤酒中，β-葡聚糖會與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致霧狀混濁和凝膠沉淀，降低啤酒的非生物穩(wěn)定性。啤酒生產(chǎn)中添加β-葡聚糖酶可將β-葡聚糖降解為低聚糖和葡萄糖，降低麥汁粘度，從而大大提高過濾速度，增加生產(chǎn)效率。大麥一般不用做人類食物的直接來源，價格低廉，但若直接作為動物飼料使用時其中含有的β-葡聚糖會造成單胃哺乳動物(如豬)和禽類消化道液體粘稠，影響營養(yǎng)成分的吸收，故β-葡聚糖被稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子。在大麥為主要原料的飼料中添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶，降解β-葡聚糖，降低消化道內(nèi)液體的粘度，改善禽畜腸胃道環(huán)境，提高營養(yǎng)的吸收效率，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用。這對幫助飼料工業(yè)開辟一條具有高經(jīng)濟(jì)價值的道路具有實際意義。Cantwell于1983年首次克隆和表達(dá)了來自β-1，3-1，4-葡聚糖酶，此后不斷有芽孢桿菌屬和非芽孢桿菌屬的該基因得到克隆和表達(dá)。

巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(MCR)3′端帶有his-tag和c-mycepitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測和純化，而且在MCR5′端引入了alpha?factor

(α-factor)用以增加表達(dá)，并且在表達(dá)后α-factor可以自動被切除。在進(jìn)行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇(甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)耐高溫β-葡聚糖酶畢赤酵母及其構(gòu)建。本發(fā)明的技術(shù)方案為：

1.淀粉液化芽孢桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性提高突變體基因的開放閱讀框序列為序列1。

2.一株高產(chǎn)耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母，其含有基因序列1，分類命名為：巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris?GS115-pPICZαA-bgl)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.3520

3.以重組質(zhì)粒pET-28a-bgl為模板，PPICZαA-F(AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAACGAGTGTTGCTAAT)和PPICZαA-R(GCTCTAGACCTTTTTTTGTATAGCGCAC)為PCR引物擴增，擴增的DNA片段與實際大小一致，約720bp。通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到耐溫性β-葡聚糖酶基因bgl。

4.基因bgl。及質(zhì)粒pPICZαA經(jīng)NotI和Xba?I雙酶切回收后，再經(jīng)T₄DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化Trans?5α，在Zeisin?LLB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。結(jié)果如表1，表2，表3所示。

5.將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用Not?I和Xba?I雙酶切進(jìn)行鑒定和PCR檢測，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后釋放一條720bp左右的片段，該片段與PCR產(chǎn)物大小一致，初步表明重組質(zhì)粒pPICZαA-bgl構(gòu)建成功。經(jīng)測序證明，bgl基因序列嵌入到pPICZαA的5’AOX?1和AOX?1TT之間，并保持了AOX?1控制下的正確閱讀框。

表1PCR擴增產(chǎn)物NotI和Xba?I雙酶切體系(50μL)

表2pPICZαA?Not?I和Xba?I雙酶切體系(50μL)

表3表達(dá)載體pPICZαA與目的基因的連接體系(10μL)

6.將含有pPICZαA-bgl的Trans5α重組菌大量培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取后，采用Pme?I線性化并純化后用于畢赤酵母轉(zhuǎn)導(dǎo)。