[發明專利]一株高產耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母及其構建

無效

• 申請號: 200910264850.1
• 申請日: 2009-12-24
• 公開（公告）號: CN101899458A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 李崎;李永仙;鄭飛云;劉春鳳;顧國賢;秦久福
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84;C12R1/07
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1.淀粉液化芽孢桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶熱穩定性提高突變體基因的開放閱讀框序列為序列1。

2.一株高產耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母，其含有基因序列1，分類命名為：巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris?GS115-pPICZαA-bgl)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.3520。

3.高產耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastorisGS115-pPICZαA-bgl)的構建法，其特征如下：

A.以重組質粒pET-28a-bgl為模板，PPICZαA-F(AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAACGAGTGTTGCTAAT)和PPICZαA-R(GCTCTAGACCTTTTTTTGTATAGCGCAC)為PCR引物擴增，擴增的DNA片段與實際大小一致，約720bp。通過PCR產物純化試劑盒對擴增產物進行純化，得到耐溫性β-葡聚糖酶基因bgl。

B.基因bgl。及質粒pPICZαA經Not?I和Xba?I雙酶切回收后，再經T4DNA連接酶連接，轉化Trans5α，在Zeisin?LLB平板上篩選陽性轉化子。

C.將陽性轉化子進行質粒抽提，用Not?I和Xba?I雙酶切進行鑒定和PCR檢測，發現重組質粒經酶切后釋放一條720bp左右的片段，該片段與PCR產物大小一致，初步表明重組質粒pPICZαA-bgl構建成功。經測序證明，bgl基因序列嵌入到pPICZαA的5’AOX?1和AOX?1TT之間，并保持了AOX?1控制下的正確閱讀框。

D.將含有pPICZαA-bgl的Trans5α重組菌大量培養，經質粒提取后，采用PmeI線性化并純化后用于畢赤酵母轉導。

E.重組表達載體pPICZαA-bgl經Pme?I完全酶切線性化后，電轉化Pichia?pastorisGS115并涂布Zeocin?YPDS平板，30℃倒置培養2～4天直至菌落出現。挑選陽性轉化子，接種含有Zeocin?YPD液體培養基。對轉化子進行Mut表型鑒定，得到Mut+菌株，進一步經誘導培養和酶活測定，篩選得到高產畢赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS?115-pPICZαA-bgl。

F.將Pichiapastoris?GS115-pPICZαA-bgl按Mut+誘導方式誘導產酶，通過重組菌株培養條件的優化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表達條件為：pH7.0，OD₆₀₀為2.5，甲醇的日誘導添加量為1％，甲醇誘導后菌體的培養時間為2.5-3天。在此條件下β-葡聚糖酶分泌到培養基中的蛋白表達量為190mg/L，比酶活達到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE結果顯示表達蛋白的大小為31KDa左右，與理論分子量大小吻合。