[發明專利]一種高純度耐熱β-葡聚糖酶的制備方法

無效

• 申請號: 200910264846.5
• 申請日: 2009-12-24
• 公開（公告）號: CN101921737A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 李崎;李永仙;鄭飛云;劉春鳳;顧國賢;秦久福
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種制備高純度重組耐熱β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法，屬于生化分離工程領域。

技術背景

β-1，3-1，4-葡聚糖屬植物細胞壁中的結構性非淀粉多糖，是以混合(1-3)和(1-4)β-糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于麥類和糠麩中，在大麥整粒和胚乳中的含量高達4.0％～8.0％。β-1，3-1，4-葡聚糖主要被3種葡聚糖內切酶分解，它們是β-1，4-葡聚糖酶(EC?3.2.1.4)、β-1，3-葡聚糖酶(EC?3.2.1.39)和β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC?3.2.1.73)。另外，葡聚糖外切酶也起一定的作用。其中作用最強的是β-1，3-1，4-葡聚糖酶(β-1，3-1，4-D-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶，又稱地衣多糖酶，以下簡稱β-葡聚糖酶)，它分解β-1，3-1，4-葡聚糖中β-1，3鄰接的β-1，4鍵，其水解的主要產物為三糖(3-O-β-D-纖維二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-O-β-D-纖維三糖-D-葡萄糖)。該酶早期主要應用于啤酒工業，可降低麥汁粘度，提高麥汁濾速及得率，改善啤酒風味，保持成品酒穩定性。近年來，飼料工業中發現，β-葡聚糖是谷物的重要抗營養因子，單胃動物由于自身不具備合成β-葡聚糖酶的微生物及分解β-葡聚糖的酶系，使食糜在腸道中具有較高的粘度，而阻止蛋白質和脂肪營養的吸收，降低飼料的轉化率。在飼料中添加β-葡聚糖酶，可以大大降低β-葡聚糖粘度，從而改善麥類營養價值，同時減少排泄物對環境的污染。

巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)是一種能高效表達重組蛋白的酵母，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養基中，方便蛋白純化。

目前應用于蛋白質分離純化的方法有很多，如硫酸銨分級沉淀、有機溶劑沉淀、沉淀凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析和層析聚焦等。它們的原理和適用范圍各不相同，沉淀法主要用于純化方案的開始階段，層析法則主要用?于中后期，其中以離子交換層析最為常用，占所有蛋白質純化方案的75％，這和它具有的許多優點分不開：分辨率高、交換容量高，有利于放大分離規模、應用靈活、分離原理明確、操作簡單。常用的離子交換功能基團類型有：陽離子交換劑CM(羧甲基)、S(磺甲基)，陰離子交換劑DEAE(二乙基胺乙基)、Q(季胺基)等。

本發明以本研究室構建的高產耐熱性重組Pichia?pastoris?GS?115-PpICZαA-bgl為出發菌，對其發酵并進行分離純化得到電泳純β-1，3-1，4-葡聚糖酶樣品。主要研究凍融法、酶法和超聲破碎法破壁對酶活力的影響，考察硫酸銨分級沉淀的特點，最后采用離子交換層析獲得了較純的重組酶，并用SDS-PAGE進行鑒定。重組β-葡聚糖酶粗酶液經過硫酸銨分級沉淀和DEAE-650M離子交換層析，純化倍數為22.57倍，回收率為20.06％，最終比活力達到17674U/mg。SDS-PAGE鑒定表明純化后的重組β-葡聚糖酶為一單一條帶，分子量大小約為27kDa。

發明內容

本發明基于蛋白質鹽析技術、蛋白質離子交換技術以及電泳技術，建立了簡易便捷的高純度耐熱β-1，3-1，4-葡聚糖酶的制備工藝。

1.將重組畢赤酵母劃線于YPD平板上進行活化，28℃培養2d，至長出單菌落后接種于10mL?BMGY液體培養基中，于30℃，200r/min搖床培養48h，OD₆₀₀達2～6，3000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1-2次。

2.將菌體用BMMY誘導培養基稀釋至OD₆₀₀＝1，用4層紗布代替棉花塞，于30℃，200r/min搖床培養。每天補加甲醇至終濃度為0.5％(V/V)，誘導3d后每隔24h從BMMY培養基中取出1mL菌液于1.5mL離心管中，然后補加1mL?BMMY于三角瓶中。

3.將一定量發酵液置于-20℃冷凍過夜，37℃解凍，離心去除菌體，獲取粗酶液A。

4.量取一定量的粗酶液A，加入20％的硫酸銨，靜置0.5h，4℃，8000r/min離心20min，取上清至另一離心管中，增加硫酸銨的濃度至40％，靜置0.5h，4℃，10000g離心30min，棄上清，加入pH.6.5磷酸緩沖液復溶沉淀，得到粗酶液B。

5.將粗酶液B裝入處理好的透析袋中，置于去離子水中4℃下過夜，中間更換去離子水數次。