[發明專利]一種高純度耐熱β-葡聚糖酶的制備方法

無效

• 申請號: 200910264846.5
• 申請日: 2009-12-24
• 公開（公告）號: CN101921737A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 李崎;李永仙;鄭飛云;劉春鳳;顧國賢;秦久福
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種制備高純度耐熱β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法，其特征是方法步驟為：

1.將重組畢赤酵母劃線于YPD平板上進行活化，28℃培養2d，至長出單菌落后接種于10mL?BMGY液體培養基中，于30℃，200r/min搖床培養48h，OD₆₀₀達2～6，3000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1～2次。

2.將菌體用BMMY誘導培養基稀釋至OD₆₀₀＝1，用4層紗布代替棉花塞，于30℃，200r/min搖床培養。每天補加甲醇至終濃度為0.5％(V/V)，誘導3d的后每隔24h從BMMY培養基中取出1mL菌液于1.5mL離心管中，然后補加1mLBMMY于三角瓶中。

3.將一定量發酵液置于-20℃冷凍過夜，37℃解凍，離心去除菌體，獲取粗酶液A。

4.量取一定量的粗酶液A，加入20％的硫酸銨，靜置0.5h，4℃，8000r/min離心20min，取上清至另一離心管中，增加硫酸銨的濃度至40％，靜置0.5h，4℃，10000g離心30min，棄上清，加入pH?6.5磷酸緩沖液復溶沉淀，得到粗酶液B。

5.將粗酶液B裝入處理好的透析袋中，置于去離子水中4℃下過夜，中間更換去離子水數次。

6.將透析后的酶液上樣DEAE-650M離子交換柱(2.6×40cm，0.02mol/L?pH6.5NaH₂PO₄-Na₂HPO₄緩沖液預平衡，柱體積100mL)，上樣量50mL，依次用含0、0.1、0.2mol/L?NaCl的0.02mol/L?NaH₂PO₄-Na₂HPO₄緩沖液(pH6.5)洗脫，2mL/min計時收集。

7.取離子交換后精制酶液進行SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％，電泳結束后用考馬斯亮藍R-250染色，獲得其純度數據，經相關軟件分析，所獲酶樣品β-1，3-1，4-葡聚糖酶純度達到90％以上。

8.所獲高純度β-1，3-1，4-葡聚糖酶4℃冷藏。