[發明專利]一種豇豆重花葉病毒反轉錄PCR分子檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910264108.0
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN101824485A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 李彬;粟寒;吳翠萍;李艷華;陳貫源;鄭斯竹;楊靜;安榆林
• 申請（專利權）人: 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明涉及一種豇豆重花葉病毒(Cowpea?severe?mosaic?virus，CPSMV)檢測的試劑盒及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

豇豆重花葉病毒(CPSMV)屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)豇豆花葉病毒屬(Comovirus)的確定種。該病毒的自然寄主為豆科植物，可嚴重侵染豇豆、大豆等多種作物。該病毒侵染豇豆后，可造成葉片花葉和斑駁，嚴重的可導致整株枯死；在田間對豇豆的侵染率可達100％，造成產量損失可達50％。

目前CPSMV主要分布在美洲地區，如美國、巴西、秘魯、委內瑞拉、特立尼達、波多黎各、哥斯達黎加和蘇里南等國，中國尚無發生與危害的報道。

CPSMV可通過種子進行遠距離傳播，其中豇豆的種傳率為10％，長豇豆(Vignasesquipedalis)的種傳率為8％；在田間，該病毒還可以通過菜豆葉甲(Ceratomatrifurcata)，帶斑黃瓜葉甲(Diabrotica?balteata)和南美葉甲(D.speciosa)等媒介昆蟲及機械傳播。該病毒的自然寄主在中國廣泛種植，且氣候條件與該病毒發生地的氣候條件相似，因此，CPSMV傳入、定殖和擴散的可能性都很大，并可隨種子的調運或害蟲的遷移而在國內傳播。CPSMV已成為我國豆科植物尤其是豇豆和大豆生產潛在的巨大威脅。

鑒于該病毒的自然寄主豇豆和大豆等為中國的主要經濟作物，能夠對其造成很大的危害，中國已將該病毒列入“中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄”。

目前，CPSMV多采用DAS-ELISA試劑盒(即雙抗夾心酶聯免疫吸附法)檢測，但該方法不夠快速、靈敏、準確，難以適合檢疫口岸使用。

發明內容

本發明的目的是提供一種適宜于檢疫口岸使用的豇豆重花葉病毒反轉錄PCR分子檢測試劑盒，以便于口岸簡便、快速、準確地對進口的豇豆種子進行豇豆重花葉病毒的檢測。

本發明從豇豆種子或植株中提取病毒RNA，進行豇豆重花葉病毒RT-PCR檢測。

本發明提供一種豇豆重花葉病毒反轉錄PCR分子檢測試劑盒，包括如下試劑：dNTP混合物、無RNase的ddH₂O、5×RT?Buffer、RNase抑制劑、反轉錄酶、10×PCR?Buffer、MgCl₂溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq?DNA聚合酶和ddH₂O；所述CPSMVf序列為5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中R＝A或G，N＝I(次黃嘌呤核苷酸)，M＝A或C；所述CPSMVr序列為5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，其中N＝I(次黃嘌呤核苷酸)，R＝A或G。

該豇豆重花葉病毒反轉錄PCR分子檢測試劑盒，還含有用作陽性對照的豇豆重花葉病毒凍干粉。

本發明還提供利用所述試劑盒檢測豇豆重花葉病毒的方法，包括如下步驟：

(1)分別提取樣品及所述豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA；

(2)反轉錄反應：以步驟(1)所述樣品RNA為模板，以CPSMVr為引物進行反轉錄反應，獲得反轉錄產物；陽性對照中的模板為所述的豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA；

(3)以步驟(2)所述的反轉錄產物為模板，以CPSMVf和CPSMVr為引物進行PCR反應，獲得PCR產物；

(4)取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR電泳圖譜中，對應于樣品RNA的泳道在356bp處有特異性擴增條帶，則該樣品感染了CPSMV。

步驟(2)所述反轉錄反應步驟為：在PCR管中配制反轉錄反應液，其組成為1μL濃度為10μM的CPSMVr，1μL濃度為10mmol/L的dNTP混合物，樣品RNA，用無RNase的ddH₂O補足體系至10μL；反應程序為：65℃反應5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中繼續添加如下成分：4μL的5×RT?Buffer，0.5μL濃度為40U/μL的RNase抑制劑，1μL濃度為200U/μL的RTase，4.5μL無RNase的ddH₂O，反應程序為：42℃反應60min，70℃反應15min。