[發明專利]一種豇豆重花葉病毒反轉錄PCR分子檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910264108.0
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN101824485A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 李彬;粟寒;吳翠萍;李艷華;陳貫源;鄭斯竹;楊靜;安榆林
• 申請（專利權）人: 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

1.一種豇豆重花葉病毒反轉錄PCR分子檢測試劑盒，包括如下試劑：dNTP混合物、無RNase的ddH₂O、5×RT?Buffer、RNase抑制劑、反轉錄酶、10×PCR?Buffer、MgCl₂溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq?DNA聚合酶和ddH₂O；所述CPSMVf序列為5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中R＝A或G，N＝次黃嘌呤核苷酸，M＝A或C；所述CPSMVr序列為5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，其中N＝次黃嘌呤核苷酸，R＝A或G。

2.根據權利要求1所述的豇豆重花葉病毒反轉錄PCR分子檢測試劑盒，其特征在于還含有用作陽性對照的豇豆重花葉病毒凍干粉。

3.一種采用權利要求2所述的試劑盒檢測豇豆重花葉病毒的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)分別提取樣品及所述豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA；

(2)反轉錄反應：以步驟(1)所述樣品RNA為模板，以CPSMVr為引物進行反轉錄反應，獲得反轉錄產物；陽性對照中的模板為所述的豇豆重花葉病毒凍干粉的RNA；

(3)以步驟(2)所述的反轉錄產物為模板，以CPSMVf和CPSMVr為引物進行PCR反應，獲得PCR產物；

(4)取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR電泳圖譜中，對應于樣品RNA的泳道在356bp處有特異性擴增條帶，則該樣品感染了CPSMV。

4.根據權利要求3所述的檢測豇豆重花葉病毒的方法，其特征在于：步驟(2)所述反轉錄反應步驟為：在PCR管中配制反轉錄反應液，其組成為樣品RNA、1μL濃度為10μM的CPSMVr和1μL濃度為10mmol/L的dNTP混合物，用無RNase的ddH₂O補足體系至10μL；反應程序為：65℃反應5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中繼續添加如下成分：4μL的5×RT?Buffer、0.5μL濃度為40U/μL的RNase抑制劑、1μL濃度為200U/μL的Rtase和4.5μL無RNase的ddH₂O，反應程序為：42℃反應60min，70℃反應15min。

5.根據權利要求3或4所述的檢測豇豆重花葉病毒的方法，其特征在于：步驟

(3)所述PCR反應體系的組成為：2μL的10×PCR?Buffer、2μL濃度為25mM的MgCl₂、2μL濃度為2.5mM的dNTP混合物、濃度為20μM的CPSMVf和CPSMVr各0.5μL、0.2μL濃度為5U/μL的Taq?DNA聚合酶和2μL所述反轉錄產物，以ddH₂O補足體系至20μL；所述PCR反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性45s，52℃復性45s，72℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸5min。