[發明專利]一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法

無效

• 申請號: 200910263600.6
• 申請日: 2009-12-28
• 公開（公告）號: CN101985618A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 陳珂;尹春英;胡尚連;阮莉萍;焦娟玉
• 申請（專利權）人: 陳珂
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/04;C07H1/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因組DNA提取方法，具體為一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法。

背景技術

傳統的植物基因組DNA提取方法中，多采用的是CTAB(2％)法，但小桐子屬于大戟科，是多乳汁型的植物，即使是在葉片中乳汁含量也很高，含有大量的多糖和多酚成分，傳統的陽離子型去污劑十六烷及三甲基溴化銨(2％CTAB)法是無法有效去除這些雜質以獲得高質量的基因組DNA。

發明內容

本發明正是針對以上技術問題，提供一種能有效去除雜質，優化DNA提取和純化操作流程的一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法。

本發明的具體技術方案如下：

一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法，包括以下步驟：

a)DNA的提取：先采集小桐子新鮮的嫩葉片，用蒸餾水清洗干凈，將葉片表面水分擦凈；將葉片0.1-0.2克在研缽中加液氮磨成粉末，研磨的時候加入約10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)以防止氧化；再將研磨的粉末轉移到2mL離心管，加入0.5ml?65℃預熱的4×CTAB抽提緩沖液(4％CTAB，20mM?EDTA，3.5MNaCl，100mM?Tris-HCl?pH?8.0和2％β-巰基乙醇)，充分搖勻，再于65℃水浴90分鐘，每5分鐘緩慢搖動一次，使混合物進一步充分混勻；待混合物冷至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1，V?V^-1)輕柔混勻并抽提，每次抽提時間為5分鐘；以8000轉/分鐘高速離心8分鐘后取上層液體；用氯仿/異戊醇(24∶1，V?V^-1)重復抽提一次；定量移取上層清液于新的2ml離心管中，再加入5M?NaCl(在混合液中達到終濃度為2M)和0.6倍體積的異丙醇，室溫孵育1小時；移取上清液，加入2倍體積80％乙醇，并在室溫放置10分鐘，以使DNA沉淀；以10,000轉/分鐘高速離心15分鐘；棄上層液體，獲得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室溫或通氣風干DNA，用200uLTE溶液溶解。

b)DNA的純化：在粗DNA的TE溶液中加入20uL?10mg/mL的RNA酶，于37℃處理30分鐘以去除RNA；加入等體積的Tris飽和酚，混合均勻(注意動作輕柔，避免引起DNA斷裂)，直至形成乳白狀混合物；以10,000轉/分鐘高速離心5分鐘；將上清液移至新的2mL離心管；再用氯仿/異戊醇(24∶1，V?V^-1)抽提兩次；移取的上清液用0.6倍體積的異丙醇(NaCl終濃度為2.0M)孵育10分鐘；移取上清液，加入20uL醋酸鈉和1倍體積的80％乙醇，靜置30分鐘，以10,000轉/分鐘高速離心15分鐘，收獲DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗滌2次，風干后用50uL?TE溶液溶解。

c)于-20℃下保存備用。

d)用紫外分光光度計在260nm、280nm和230nm下對DNA進行純度和濃度檢測。

一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中增加了提取緩沖液CTAB的濃度，達到了4％。提取緩沖液的NaCl濃度達到了3.5M，優化了能源植物小桐子基因組DNA的提取。

一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中，在DNA的純化中增加了用Tris飽和酚單獨抽提的步驟，純化了能源植物小桐子基因組DNA的提取。

一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中，使用的是在2.0M?NaCl條件下用80％乙醇進行DNA的沉淀，且所有步驟可以在室溫下操作這樣獲得小桐子優質的基因組DNA適于各種分子遺傳研究方面應用。

本發明的技術效果表現在：可提取高質量的能源植物小桐子基因組DNA，并能用于小桐子的種群遺傳學、系統進化、分子標記輔助育種等研究。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明作進一步說明

實施例：

一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法，包括以下步驟：