[發明專利]一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法

無效

• 申請號: 200910263600.6
• 申請日: 2009-12-28
• 公開（公告）號: CN101985618A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 陳珂;尹春英;胡尚連;阮莉萍;焦娟玉
• 申請（專利權）人: 陳珂
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/04;C07H1/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法，其特征在于：

包括以下步驟：

a)DNA的提取：先采集小桐子新鮮的嫩葉片，用蒸餾水清洗干凈，將葉片表面水分擦凈；將葉片0.1-0.2克在研缽中加液氮磨成粉末，研磨的時候加入約10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)；再將研磨的粉末轉移到2mL離心管，加入0.5ml?65℃預熱的4×CTAB抽提緩沖液(4％CTAB，20mM?EDTA，3.5M?NaCl，100mM?Tris-HCl?pH?8.0和2％β-巰基乙醇)，充分搖勻，再于65℃水浴90分鐘，每5分鐘緩慢搖動一次；待混合物冷至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1，V?V^-1)輕柔混勻并抽提，每次抽提時間為5分鐘；以8000轉/分鐘高速離心8分鐘后取上層液體；用氯仿/異戊醇(24∶1，V?V^-1)重復抽提一次；定量移取上層清液于新的2ml離心管中，再加入5M?NaCl(在混合液中達到終濃度為2M)和0.6倍體積的異丙醇，室溫孵育1小時；移取上清液，加入2倍體積80％乙醇，并在室溫放置10分鐘，以使DNA沉淀；以10,000轉/分鐘高速離心15分鐘；棄上層液體，獲得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室溫或通氣風干DNA，用200uLTE溶液溶解。

b)DNA的純化：在粗DNA的TE溶液中加入20uL?10mg/mL的RNA酶，于37℃處理30分鐘以去除RNA；加入等體積的Tris飽和酚，混合均勻直至形成乳白狀混合物；以10,000轉/分鐘高速離心5分鐘；將上清液移至新的2mL離心管；再用氯仿/異戊醇(24∶1，V?V^-1)抽提兩次；移取的上清液用0.6倍體積的異丙醇(NaCl終濃度為2.0M)孵育10分鐘；移取上清液，加入20uL醋酸鈉和1倍體積的80％乙醇，靜置30分鐘，以10,000轉/分鐘高速離心15分鐘，收獲DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗滌2次，風干后用50uL?TE溶液溶解。

c)于-20℃下保存備用。

d)用紫外分光光度計在260nm、280nm和230nm下對DNA進行純度和濃度檢測。