[發明專利]微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法

在審

• 申請號: 200910256588.6
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN102115767A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 曹務波;陳遠童;曹荀梅子
• 申請（專利權）人: 曹務波
• 主分類號: C12P7/44
• 分類號: C12P7/44;C12R1/74
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

技術領域：

本發明涉及微生物同步發酵正烷烴生產長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是發酵正十一烷(以下簡稱nC₁₁)高產α，ω-十一碳二羧酸(以下簡稱DC₁₁)的方法。

背景技術：

C₁₀以上的長鏈二元酸是化工上合成高級香料、高級尼龍工程塑料、高檔服裝用尼龍熱熔膠、高溫電解質、高級涂料、潤滑油和耐寒性增塑劑等的重要原料，尤其是十三碳二元酸(DC₁₃)和十五碳二元酸(DC₁₅)，它們分別是合成日用香料麝香-T和名貴香料麝香酮的重要原料。

C₁₀以上的長鏈二元酸，在自然界中不單獨存在，只有少數幾種二元酸可以從植物油中裂解制取，例如癸二酸(DC₁₀)可從蓖麻籽油裂解制取；DC₁₃可從菜籽油中抽提出甘油芥酸酯再用臭氧氧化方法生產；DC₁₅可從蒜頭果油中的腦神經酸裂解制取。但它們都受農田和氣候的限制，遠不能滿足需要。除DC₁₂以外，化工上至今也還沒有經濟可行的合成路線和方法。微生物學家應用生物工程技術，利用微生物發酵石油中的正構烷烴生產相應鏈長的二元酸，彌補了化工上的不足，開辟了長鏈二元酸的新來源。

七十年代以前，各國科學家對微生物發酵生產二元酸的研究，只處于理論研究階段，所產生和積累的二元酸也都是十個碳以下的短鏈二元酸，七十年代以后，進入應用研究階段，通過大量的菌種誘變篩選，培育出一批新突變菌株，能從十個碳以上的正烷烴產生和積累與基質鏈長相同的長鏈二元酸，并通過不斷的培育和代謝調控研究，使每升發酵液中二元酸的積累從開始時的幾克、十幾克、幾十克，提高到目前的一百多克。八十年代以來，二元酸的研究進入小規模工業化生產階段，并出現了幾個有實際生產價值的文獻。

十一碳二元酸(DC₁₁)是化工上合成尼龍工程塑料、潤滑油和農藥等的重要原料。至今國內外還沒有經濟可行的化工合成方法。用生物合成法合成生產DC₁₁的報道不多。目前報道的最好的十一碳二元酸的發酵生產結果為：在200m³發酵罐中，發酵時間165小時，發酵液中DC₁₁含量為120.4g/L，烷烴轉化率為64.55％。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種新的微生物菌種，以及利用該微生物菌種同步發酵正烷烴生產C₁₀-C₁₈長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是同步發酵正十一烷烴，高產α，ω-十一碳二元酸的方法。

本發明所提供的菌種為熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-1，是以一株氧化正烷烴生產混合二羧酸的熱帶假絲酵母【參見《微生物學報》20(1)：88-93，1980】為出發菌株，通過紫外線照射誘變、篩選培育出來的，具體步驟如下：

接一接種環上述熱帶假絲酵母菌體，裝于25ml麥芽汁液體培養15小時，分別取3ml種液放入滅過菌并帶有一個玻璃磁轉子的培養皿中，打開培養皿蓋，在24W的紫外線燈下16cm處照射1min、2min、3min、4min，不同照射劑量的菌液稀釋10^-1，在黑暗處放置2小時，用生理鹽水分別稀釋菌液10^-4-10^-6，吸取稀釋好的菌液0.1m涂布于10個巴林糖度的麥芽汁瓊脂培養平板上，每個稀釋度涂布3個平板。將涂好的平皿用黑紙包好，置于28℃的培養箱中培養2天，統計致死率。

菌種篩選：以出發菌株為對照，對誘變后的菌株進行發酵產酸試驗及產酸量檢測，篩選出高產α，ω-十一碳二羧酸的菌株，即為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)ly-1，該菌種能以C₁₀-C₁₈的各種單一正烷烴和混合正烷烴，尤其是正十一烷為基質原料，發酵生產出相應的長鏈二羧酸。

本發明熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-1已于2009年10月14日在中國典型培養物保藏中心進行保藏，地址為中國武漢武漢大學，保藏號為：CCTCC?NO：M?209223。

熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)ly-1的生理特性如下：

糖類的發酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。

同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，