[發明專利]基于雀稗固氮菌的根際促生菌肥及其制備方法

無效

• 申請號: 200910256099.0
• 申請日: 2009-12-29
• 公開（公告）號: CN102108335A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發明（設計）人: 陳宏坤;范玲超;葛雨明
• 申請（專利權）人: 山東金正大生態工程股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C05F11/08;C12R1/01
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 許德山

1.雀稗固氮菌，其特征是，通過下述步驟獲得：

A.土樣采集：樣品采自臨沂地區小麥根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，低溫保存；

B.培養基：

(1)LB培養基：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl?10g、Agar?20g，總體積1000ml，pH?7.0-7.5；

(2)NFM培養基：蘋果酸5g、K₂PHO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O?0.2g、CaCl₂·2H₂O?0.02g、NaCl?0.1g、NaMoO₄·2H₂O?0.002g、KOH?4.5g、Bromothymol?Blue?5ml、Biotine?10ug、Agar2％，總體積1000ml，pH7.0-7.5；

(3)CCM培養基：KH₂PO₄0.2g、NaCl?0.1g、K₂HPO₄0.8g、Na2FeEDTA28mg、鉬酸鈉25mg、酵母浸膏100mg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸鈉0.5ml、蒸餾水900ml；

C.菌株篩選方法：取樣品1g，在無菌條件下用0.85％生理鹽水配成10^-4、10^-5、10^-6三個稀釋度，各稀釋度的懸浮液接種于盛有半固體NFM、CCM培養基的血清試管瓶中，28-30℃培養48h后，注入1mlC₂H₂，再置于28-30℃培養24h-48h后，對有C₂H₄產生的樣品以平板劃線法將其分別再培養于LB、NFM、CCM平板培養基上，置于28-30℃的培養箱中培養24-48h，然后分別挑取不同的典型單個菌落，并接種于新準備的CCM、NFM血清小瓶中，測定其固氮活性，挑選出生長快、圈大的菌落再分離純化后，轉斜面4℃保藏。

2.一種根際促生菌肥，其特征在于：由每500-700g吸附劑中加入130-170ml菌懸液制成，雀稗固氮菌活菌數0.5x10⁸-2x10⁸cfu/g。

3.權利要求2所述的根際促生菌肥，其特征在于：所述的吸附劑為泥炭、活性碳、蛭石或它們的混合物。

4.權利要求3所述的根際促生菌肥，其特征在于：所述的吸附劑為泥炭。

5.一種根際促生菌肥的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

A.菌懸液的制備：

(1)雀稗固氮菌斜面：28-30℃，培養2-3d；

(2)搖瓶種子培養：培養瓶盛培養基300ml，121℃滅菌20-30min，冷卻后接入1ml斜面菌株，置于28℃振蕩培養，搖床轉速125rpm/min，培養時間2-3d；

(3)擴大發酵：300L發酵罐裝入培養基150L，121℃滅菌后置于室溫下2-3d，經檢查無污染后，接入15L種子培養液，置于28℃下的軌道搖床，轉速為125rpm/min，培養時間3-4d，所得即為菌懸液；

B.吸附劑的處理：將吸附劑干燥、粉碎，過100目篩，121℃滅菌2-3h，分裝500g/袋備用；

C.菌肥接種和培養：用已滅菌的量筒量取150ml菌懸液接種到500g滅菌的吸附劑中，在無菌操作下裝入塑料包裝袋中立即封口，并將菌懸液與吸附劑混勻，再用滅菌針在塑料袋的四周及中間扎幾個孔，置于28-30℃培養6-7d，使雀稗固氮菌進一步繁殖，活菌數均在10⁸個/g，包裝后常溫下保存，即為根際促生菌肥。

6.權利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)的培養基是：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl?10g、Agar?20g，蒸餾水1000ml，pH?7.0-7.5。

7.權利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)和步驟(3)的培養基是：糖漿10g、酵母膏5g、CMC-Na5g、KH₂PO₄0.5g、MgSO₄0.25g、蒸餾水1000ml，pH?7.0-7.5。