[發明專利]一種鐵離子固定化親和色譜整體柱的制備方法

有效

• 申請號: 200910248846.6
• 申請日: 2009-12-28
• 公開（公告）號: CN102108095A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發明（設計）人: 張麗華;張麗媛;王暉;梁振;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;B01J20/286
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳;周秀梅

技術領域

本發明涉及用于在線或離線磷酸化肽段選擇性富集分離的固定化親和色譜整體柱，具體地說是一種鐵離子固定化親和色譜整體柱的制備。

背景技術

蛋白質磷酸化是最普遍的翻譯后修飾之一，在生命過程中扮演著信號傳導、代謝調節、細胞功能調控等重要作用。然而，磷酸化蛋白/肽段通常含量較低，在質譜分析中常受到大量非磷酸化蛋白/肽段的干擾。因此，發展針對磷酸化肽段的選擇性富集技術對于深入開展磷酸化蛋白質組研究至關重要。

基于固載金屬離子與磷酸根間的特異相互作用的固定化金屬親和色譜是目前最常用的磷酸化富集技術之一(Chaga?G?S.J.Biochem.Biophys.Methods.2001，49，313-334)。次氨基三乙酸是一種具有四齒結構的螯合化合物，其與金屬離子的結合能力要大于三齒配體亞氨基二乙酸。因此，目前以次氨基三乙酸為配體，以硅膠、樹脂或瓊脂糖為基質材料的固定化金屬親和色譜材料已成功用于磷酸化肽段的選擇性富集(Dunn?J?D；Watson?J?T；Bruening?M?L.Anal.Chem.2006，78，1574-1580)。然而盡管硅膠具有較好的機械性能，但耐酸堿性能差；樹脂和瓊脂糖適用的pH范圍較寬，但機械強度差。

近年來，有機聚合物整體材料因具有制備簡單、結構容易控制、易實現化學修飾、傳質效率高及耐酸堿等優點受到廣泛關注(Vizioli?N?M，RusellM?L；Carbajal?M?L；Carducci?C?N；Grasselli?M.Electrophoresis，2005，26，2942-2948)。然而現有的有機聚合物整體材料的功能基團一般為傳統的環氧基，其表面官能團活性低，需經過高溫以及強酸堿處理以進行化學修飾(Duan?J?C；Sun?L?L；Liang?Z；Zhang?J；Wang?H；Zhang?L?H；Zhang?W?B；ZhangY?K.J.Chromatogr.A，2006，1106，165-174)。這不僅會影響材料的結構以及基質與管壁的鍵合，而且操作步驟繁瑣、反應時間長、制備的材料重現性較差。在磷酸化蛋白組學研究中，磷酸化肽段富集的重現性是獲得可靠分析結果的必需條件。因此，發展具有高活性官能團的固定化金屬離子親和色譜整體柱對于實現磷酸化肽段分離鑒定具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鐵離子固定化親和色譜整體柱的制備方法，以期解決金屬離子固定化親和色譜整體柱制備過程中化學修飾時間長，操作過程繁瑣，固定化金屬離子親和色譜整體柱制備重現性差，所得親和色譜整體柱性能不穩定等缺點。該鐵離子固定化親和色譜整體柱主要用于在線或離線選擇性富集磷酸肽。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

根據樣品預處理量的不同選用不同管徑的熔融毛細管柱。以N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺為功能單體，乙叉二甲基丙烯酸乙酯為交聯劑，環己醇、十二醇和N，N-二甲基甲酰胺的混合物為致孔劑，偶氮二異丁腈為引發劑聚合而得的多孔整體柱基質。整體柱基質繼而通過表面修飾反應，使其表面鍵合上含羧基的功能團，以用于后續的鐵離子固定。最后通入含鐵離子的溶液，實現鐵離子的固定化。

具體為：

1)將N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺、乙叉二甲基丙烯酸乙酯、環己醇、十二醇、N，N-二甲基甲酰胺、偶氮二異丁腈混合均勻后，于室溫下通氮氣以除去溶解其中的氧氣；隨后將該反應液通入處理后的熔融石英毛細管中，并立即用硅橡膠封閉毛細管兩端，置于52-58℃水浴中反應14-18h完成基質聚合反應。

3.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

功能單體、交聯劑和致孔劑三者之間的質量比例范圍為2∶3∶5-2.2∶2.9∶4.9；

致孔劑中環己醇、十二醇和N，N-二甲基甲酰胺三者之間的質量比例范圍為76∶9∶15-72∶8∶20；

引發劑的用量為功能單體、交聯劑和致孔劑三者總質量的0.5-1.0％。

2)表面修飾反應過程：在填充了基質材料的毛細管中通入0.02-0.2mol/L的N，N-二羧基甲基-L-賴氨酸溶液，溶液的pH值為8-10.0，在室溫下反應0.5-2h，進行基質表面的化學修飾；整體柱基質通過表面修飾反應，使其表面鍵合上含羧基的功能團，以用于后續的鐵離子固定。

在整體柱基質通過表面修飾反應后，用甲酸體積分數為0.05-0.2％的溶液沖洗基質材料至流出液為酸性。