[發明專利]含硫氨基酸的檢測方法

有效

• 申請號: 200910248427.2
• 申請日: 2009-12-15
• 公開（公告）號: CN101738440A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 于淑新;馮思;韓晶;孫元社;唐濤;李彤
• 申請（專利權）人: 大連依利特分析儀器有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/36;G01N30/74
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域：

本發明屬于化學分析檢測領域，尤其是一種操作簡單、檢測成本低，具有 高準確性和高靈敏度的含硫氨基酸的檢測方法。

背景技術：

含硫氨基酸通常指蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸，在生物體代謝過程中具有 至關重要的作用。蛋氨酸是含硫必需氨基酸，與生物體內各種含硫化合物的代 謝密切相關，當生物體缺乏蛋氨酸時，會引起食欲減退、生長減緩或不增加體 重、腎臟腫大以及肝臟鐵堆積等現象，最后導致肝壞死或纖維化；蛋氨酸還可 利用其所帶的甲基，對有毒物或藥物進行甲基化而起到解毒的作用。因此，目 前蛋氨酸可用于防治慢性或急性肝炎、肝硬化等肝臟疾病，也可用于緩解砷、 三氯甲烷、四氯化碳、苯、吡啶和喹啉等有害物質的毒性反應。胱氨酸及半胱 氨酸是含硫的非必需氨基酸，可降低人體對蛋氨酸的需要量。胱氨酸是形成皮 膚不可缺少的物質，能加速燒傷傷口的康復及放射性損傷的化學保護，刺激紅、 白細胞的增加；半胱氨酸所帶的巰基(-SH)具有許多生理作用，可緩解有毒 物或有毒藥物(酚、苯、萘、氰離子)的中毒程度，對放射線也有防治效果。 半胱氨酸的衍生物N-乙酰-L-半胱氨酸也因巰基的作用，具有降低粘度的效果， 可作為粘液溶解劑，用于防治支氣管炎等咳痰的排出困難。因此，對含硫氨基 酸含量的測定具有非常重要的意義。

目前國內外使用的檢測方法有化學分析法、電化學方法、分光光度法、高 效液相色譜法、毛細管電泳法及氣相色譜法等。高效液相色譜法是目前使用最 為普遍的檢測方法，而高效液相色譜法中的離子交換法和反相色譜法又是應用 最廣泛的兩種。對于飼料中含硫氨基酸檢測的國家標準，采用的是離子交換色 譜法，使用氨基酸分析儀。也有很多文獻報道采用氧化水解-離子交換色譜法測 定飼料中的含硫氨基酸，即先將含硫氨基酸首先氧化為對酸穩定的產物，再通 過酸水解將氧化產物從蛋白中釋放出來，用離子交換色譜法進行分析檢測，也 需要使用氨基酸分析儀。由于氨基酸分析儀專屬性強、造價高，導致含硫氨基 酸檢測的成本較高，故檢測的普及率較低。

發明內容：

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、 檢測成本低，具有高準確性和高靈敏度的含硫氨基酸的檢測方法。

本發明的技術解決方案是：一種含硫氨基酸的檢測方法，其特征在于按如

下步驟進行：

a.將胱氨酸和蛋氨酸氧化，再通過酸解，制取磺基丙氨酸和蛋氨酸砜；

b.將衍生試劑2，4-二硝基氟苯與磺基丙氨酸和蛋氨酸砜進行衍生化反應， 生成有紫外吸收的產物；

c.對衍生產物進行高效液相色譜分析。

所述a步驟是取含蛋白7.5～25mg的樣品置容器中，加入過甲酸溶液0.3mL， 冰水浴氧化反應16h；向氧化液中加入0.1mL偏重亞硫酸鈉溶液，充分搖勻后再 直接加入6.8mol/L鹽酸溶液2.5mL，容器封口并置烘箱110±3℃水解24h；將水解 液放置室溫并打開容器瓶口，將水解液氮氣吹干，用衍生緩沖溶液洗滌容器， 洗滌液轉移至25mL容量瓶，用衍生緩沖溶液定容，制取含磺基丙氨酸和蛋氨酸 砜的樣品溶液；所述過甲酸溶液是將濃度30％的過氧化氫與濃度88％的甲酸按體 積比1∶9混合，于室溫下放置1h，置冰水浴中冷卻30min而制成；所述偏重亞硫酸 鈉溶液是將3.36g偏重亞硫酸鈉加水定容至10mL；所述6.8mol/L鹽酸溶液是將純 鹽酸28mL加水稀釋至50mL；所述衍生緩沖溶液是取硼酸1.24g和硼砂7.63g，置 500mL容量瓶中加水定容并搖勻制成。

所述b步驟是將a步驟所得樣品溶液過濾并取已過濾的樣品液10mL于50mL 暗色容量瓶中，加入5mL衍生試劑，放入60℃水浴中，反應60min后冷卻至室溫， 用平衡緩沖溶液定容；所述衍生試劑是濃度為1％的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液； 所述平衡緩沖溶液是取磷酸二氫鉀0.91g和磷酸氫二鈉3.58g，置250mL容量瓶中 加水定容并搖勻。

所述c步驟的色譜流動相：流動相A，流動相B；流速：1.2mL/min；檢測波 長：360nm；所述流動相A是將相同體積的乙腈與水混合，超聲脫氣10～15min； 所述流動相B是取流動相無水乙酸鈉固體成分4.1g加水約950mL，用冰醋酸調pH 至6.4～6.8，加10mL?N，N-二甲基甲酰胺，加水定容至1000mL，搖勻后用0.45μm 微孔濾膜過濾，超聲脫氣10～15min；所述流動相梯度條件如表1：