[發明專利]含內參的HCV熒光定量RT-PCR檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200910247530.5
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN102115793A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 何劍軍;夏懿;吳大治;韓倩;沈維祥
• 申請（專利權）人: 上海復星醫學科技發展有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/93
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技術領域

本發明涉及一種含內參的使用熒光RT-PCR技術定量檢測丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法，屬于分子生物學領域。

背景技術

丙型肝炎病毒是單股正鏈RNA病毒.1991年，國際病毒命名委員會(ICTV)將其歸為黃病毒科丙型肝炎病毒屬，其基因組含有一個大約9033個核苷酸構成的大開放讀碼框(ORF)，可編碼3010-3033個氨基酸的多蛋白前體，多蛋白N端的1/4依次為核心蛋白(C)和包膜蛋白(E1和E2)等結構蛋白，其余依次為NS2、NS3、NS4和NS5等非結構蛋白，膜蛋白分布于病毒表面，NS3蛋白具有蛋白酶的功能，NS5蛋白為一依賴于RNA的RNA多聚酶。

與其他RNA病毒一樣，HCV基因組有很大的變異性，可能會引起其分子生物學行為、感染性、臨床致病性及對藥物治療的反應等諸方面的不同[3-4].現已證實，90％非腸道傳播的非甲非乙型肝炎(NANBH)為HCV感染所致，35-50％的非甲非乙型肝炎發展為慢性肝炎，與肝癌的發生相關。

HCV感染后一般到抗體轉陽有一個較長的窗口期，平均為70天，有的患者窗口期可延長至6-9個月或更長，約1-3％的患者抗-HCV可持續陰性，而基因組的復制出現得很早，感染后數天即出現病毒血癥.已有輸血后即有丙型肝炎病毒感染發生的報道，這表明抗-HCV陰性的獻血員中有少數存在丙型肝炎病毒輸血傳播的可能性；另外，美國已報道了1例抗-HCV陰性的器官捐贈者對接受移植者造成丙型肝炎病毒急性感染；Willems?et?al檢測克羅地亞不同地區輸血中心的2718份抗-HCV陰性血漿中2.1％為HCV?RNA陽性.因此直接檢測HCVRNA對于篩查窗口期HCV感染的獻血者，降低輸血后HCV感染的發病率是必要的。

外周血中檢出HCV?RNA是HCV復制活躍的可靠指標，在感染1-2wk內血清中可檢測到HCV?RNA，在感染自然恢復前血清中HCV?RNA將達到一個高峰，但HCV?RAN在達到峰值或重新出現前數天或數周內偶爾也可能檢測不到.在大多數向慢性轉化的感染者中，HCVRNA含量降低速度逐漸減慢，最后趨于穩定，晚期肝病患者的HCV?RNA水平很低，甚至無法測出。

HCV?RNA檢測包括定性和定量兩種方法，其基本原理就是逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)：首先經逆轉錄酶作用，在特異性引物存在下，將HCV?RNA逆轉錄為單鏈的cDNA，再通過PCR將cDNA擴增.定性PCR的靈敏度高于定量PCR，例如羅氏公司試劑，定性PCR的靈敏度為50kIU/L，定量PCR為600kIU/L；拜爾公司的定性PCR(轉率介導擴增法，TMA)試劑的靈敏度為10kIU/L，其定量PCR為615kIU/L，因此定性PCR主要用于急慢性丙型肝炎診斷，而定量PCR則用于療效監測[15].不同定量分析方法中的檢測單位與臨床標本的HCV?RNA實際水平的關系不完全一致，世界衛生組織制定了HCV?RNA定量分析單位的國際標準(IU)，目前分析方法檢測的下限值范圍為30-615kIU/L，上限值范圍為5×10⁵-7.7×10⁵kIU/L，特異性為98-99％，且不受基因型的影響。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速、簡便的含內參的使用熒光RT-PCR技術定量檢測HCV病毒RNA的方法。

為解決上述問題，本發明提供了一種使用一步法熒光RT-PCR技術對HCV?RNA進行定量的方法，根據GeneBank中的HCV序列為模板，設計了一對引物及特異性探針，檢測長度為114bp的目標RNA，其引物探針序列分別為：

引物1：5`-AACCAACCCGCTCAATACC-3`??????????(Seq?No.1)

引物2：5`-GCACTCGCAAGCACCCT-3`????????????(Seq?No.2)

探針1：5`-CCGCGAGATCACTAGCCGAGTAGT-3`?????(Seq?No.3)

探針2：5`-ATCTACCCAACACGAATCGCTACC-3`?????(Seq?No.4)

或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

設計的探針跨越了一段內含子，分別與其兩端的外顯子特異性匹配，這樣可非常有效的避免基因組DNA對實驗結果的影響，同時也省去了使用DNA酶對樣本進行消化用以去除DNA干擾的步驟。