[發明專利]含內參的HCV熒光定量RT-PCR檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200910247530.5
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN102115793A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 何劍軍;夏懿;吳大治;韓倩;沈維祥
• 申請（專利權）人: 上海復星醫學科技發展有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.含內參的HCV熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包含一對特異性引物、一條HCV特異性檢測探針和內參探針，分別用于檢測HCV病毒核酸RNA和人工合成的內參RNA片段，其中，用于檢測HCV病毒RNA的擴增片段長度為114bp，引物和探針序列如下：

引物1：5`-AACCAACCCGCTCAATACC-3`????????(Seq?No.1)

引物2：5`-GCACTCGCAAGCACCCT-3`??????????(Seq?No.2)

探針1：5`-CCGCGAGATCACTAGCCGAGTAGT-3`???(Seq?No.3)

探針2：5`-ATCTACCCAACACGAATCGCTACC-3`???(Seq?No.4)

或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。人工合成的內參RNA片段除探針1的結合區域更換成探針2的結合區域外，其余部分與HCV?RNA的擴增序列最好完全相同，但亦可完全不同。內參RNA片段序列如下：

內參陽模RNA：

5`- AACCAACCCGCUCAAUACCCGGAAAUUUGGGCGUGCCCAUCUACCCAACACGAAUCGCUACCGUUGGGUCGCGAAAGGCCUUGUGGUACUGCCUGAUAGG

2.含內參的HCV熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于內參DNA片段預先加入到含探針1和探針2的組成成分“探針”中，試劑盒的組成成分包括：One?step?RT-PCR反應緩沖液、探針、混合酶、校準品1、校準品2、校準品3、陽性對照品和陰性對照品。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于兩條標記探針的熒光發光基團不同，根據不同的熒光定量PCR儀器，從以下熒光基團中選擇兩個分布于不同的儀器檢測通道的兩種熒光進行組合，熒光種類為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine?Green、Rhodamine?6G、Oregon?Green?488、Oregon?Green?500、Oregon?Green514、Texas?Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine?orange和ROX；熒光淬滅基團根據選擇的熒光發光基團的種類和組合從DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的選擇一種或兩種淬滅基團。優選的方案為：兩條探針分別用FAM-BHQ1和TET-BHQ1進行標記。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于PCR反應體系包含Tris-HCl(PH?8.3)、KCl、d(AGC)TP、dUTP、MgCl₂、引物1和引物2、探針1和探針2、AMV酶、Taq酶以及適當濃度的內參陽模，試劑盒校準品為已知核酸RNA濃度并包含引物1和引物2擴增片段的人工合成RNA片段，陽性對照品為適當濃度的HBV國家標準品，陰性對照品為純凈水。

5.根據權利要求2所述的試劑盒其特征在于，按如下程序進行實時熒光PCR檢測：反應管先在42℃反應10分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→60℃45秒循環40次(60℃退火條件下采集相應探針標記通道的熒光)。