[發(fā)明專(zhuān)利]一種建立高效表達(dá)人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細(xì)胞株的方法及應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910247524.X
• 申請(qǐng)日: 2009-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102115762A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李琦;范忠澤;周利紅;王炎;劉宣
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 上海正旦專(zhuān)利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴

1.一種建立高效表達(dá)人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細(xì)胞株的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人環(huán)氧合酶2基因和熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pGL4-COX-2，

通過(guò)提取人環(huán)氧合酶2基因啟動(dòng)子，以含熒光素酶報(bào)告基因的pGL4系列質(zhì)粒為載體，插入人環(huán)氧合酶2基因啟動(dòng)子，構(gòu)建含人環(huán)氧合酶2基因啟動(dòng)子和熒光素酶報(bào)告基因的pGL4-COX-2重組質(zhì)粒；

2)建立高效表達(dá)人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細(xì)胞株HCT-116^COX-2

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含人環(huán)氧合酶2基因啟動(dòng)子和熒光素酶報(bào)告基因的pGL4-COX-2重組質(zhì)粒到人腸癌HCT-116細(xì)胞株，通過(guò)藥物加壓篩選、基因擴(kuò)增后，獲得高效表達(dá)人環(huán)氧合酶2基因的克隆細(xì)胞株HCT-116^COX-2；

所述的細(xì)胞株同時(shí)高效表達(dá)人環(huán)氧合酶2和熒光素酶活性。

2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒中所含的載體質(zhì)粒為含穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抗生素篩選基因的質(zhì)粒，其包括Hygro^r、Neo^r和Puro^r。

3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒中包含多酶切位點(diǎn)和β-內(nèi)酰胺酶基因。

4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒中所包含的載體質(zhì)粒和人環(huán)氧合酶2基因啟動(dòng)子均含有BglII和Hind?III雙酶切位點(diǎn)。

5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的熒光素酶報(bào)告基因選自螢火蟲(chóng)熒光素酶或海腎熒光素酶基因。

6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人環(huán)氧合酶2基因啟動(dòng)子序列，其長(zhǎng)度為250-700?bp，序列中包含NF-κB、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-BoX轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)和TATA框。

7.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的人環(huán)氧合酶2基因啟動(dòng)子序列，其長(zhǎng)度為562bp。

8.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的螢火蟲(chóng)熒光素酶或海腎熒光素酶基因包括luc2、luc2P、luc2CP和hRluc、hRlucP和hRlucC。

9.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL4-COX-2，通過(guò)以下步驟：

1)制備含有COX-2基因啟動(dòng)子目的序列

(1)提取含有COX-2基因啟動(dòng)子人基因組DNA；

(2)PCR擴(kuò)增、純化COX-2基因啟動(dòng)子目的序列；

2)大量制備pGL4.17載體質(zhì)粒

3)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)COX-2基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒

(1)COX-2基因啟動(dòng)子目的序列和pGL4.17載體質(zhì)粒的雙酶切；

(2)COX-2基因啟動(dòng)子目的序列和pGL4.17載體質(zhì)粒連接；

(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，含Amp^r的瓊脂平板篩選陽(yáng)性克隆；

(4)陽(yáng)性克隆單菌落的PCR鑒定，剔除假陽(yáng)性菌落；

(5)挑取陽(yáng)性克隆單菌落搖菌，大量擴(kuò)增提取制備重組質(zhì)粒；

(6)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。

10.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中建立高效表達(dá)人環(huán)氧合酶2的重組細(xì)胞株HCT-116^COX-2通過(guò)以下步驟：

1)確定G418的篩選HCT-116細(xì)胞的最低篩選濃度；

2)pGL4.17-COX-2重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞；

3)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HCT-116細(xì)胞；

(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞24h后加入G418篩選；

(2)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞簇接種及傳代培養(yǎng)；

(3)RT-PCR或Western?Blot鑒定單克隆細(xì)胞株的真陽(yáng)性；

4)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

11.權(quán)利要求1制得的人腸癌細(xì)胞株HCT-116^COX-2在抗腫瘤藥物的篩選和評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

12.按權(quán)利要求11的應(yīng)用，其特征在于所述的抗腫瘤藥物以人環(huán)氧合酶2基因?yàn)榘悬c(diǎn)。

13.按權(quán)利要求11的應(yīng)用，其特征在于所述的抗腫瘤藥物為抗腫瘤的化學(xué)藥物、生物類(lèi)藥物，中藥復(fù)方、中藥單體或單味中藥提取物。