[發明專利]一種建立高效表達人環氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法及應用

無效

• 申請號: 200910247524.X
• 申請日: 2009-12-30
• 公開（公告）號: CN102115762A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 李琦;范忠澤;周利紅;王炎;劉宣
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬普陀醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬基因工程制藥技術及應用領域，涉及一種建立高效表達人環氧合酶2(COX-2)的重組人腸癌HCT-116細胞株HCT-116^COX-2的方法及應用，具體地說，本發明涉及建立穩定轉染含人環氧合酶2(COX-2)基因啟動子編碼序列和熒光素酶報告基因序列的永生化哺乳動物細胞系，通過壓力篩選和基因擴增后，獲得穩定、靈敏、高效表達COX-2的腫瘤克隆細胞株，并將細胞株應用于以COX-2基因為靶點的抗腫瘤藥物的篩選及評價。

背景技術

研究表明，環氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(PGs)合成過程中一個重要的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產物，從而維持機體的各種病理生理過程。目前發現哺乳動物的環氧化酶至少有COX-1和COX-2兩個同工酶，COX-1在組織中的表達相當穩定，對維持胃和腎功能的平衡發揮重要的作用，而COX-2的表達在不同的組織、不同的狀況下變動很大，它的主要產物是環前列腺素和PGE₂。

現有技術公開了COX-2基因全長8.3kb，由10個外顯子和9個內含子組成，定位于第1號染色體1q^25.2～25.3，由5’端0.8kb的轉錄起始點上游區，6kb的蛋白質編碼區以及1.5kb?3’端非編碼區組成，其mRNA約4.5kb，基因編碼603或604個氨基酸，含有17個氨基酸殘基構成的信號肽，與COX-1有59％-61％的同源性。在其5’旁側區，含有幾個可能的轉錄調節序列，包括轉錄起始位點上游25bp位處共同的TATA框序列。一個C/EBP基序，兩個AP-2位點，三個SP₁位點，兩個NF-κB位點，一個CRE基序和一個EST-1位點。在蛋白質編碼區，COX-2基因的ORF起始于CTGCGATGC序列，由10個外顯子編碼。在3’旁側區，整個3’UTR包含于外顯子10，其間無內含子存在，有三個富含腺嘌呤核苷酸的序列M?TAAA，相互之間相隔280bp。

COX-2發現于某些細胞中，主要定位于核膜。因此，COX-2產生的PGs產物可進入核內，調節靶細胞基因的轉錄。研究表明COX-2不僅是啟動炎癥反應的關鍵酶，而且其表達和與腫瘤的發生、增殖、分化、浸潤、轉移及預后等方面有重要作用。研究提示，COX-2主要通過以下途徑導致胃癌的發生：(1)COX作為一種刺激因子在靜息狀態下不表達，只有在某些惡性細胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活而被活化，COX-2的轉錄后失控，使COX-2過度表達，COX-2的過氧化酶活化可催化一系列異體氧化反應，參與氧化誘癌途徑，從而形成致癌物；(2)COX-2通過催化形成PGs促進腫瘤的發生，COX-2通過催化反應可產生PGG、PGH、PGE，其中PGE為其主要代謝產物，可誘導細胞增殖，促進細胞粘附，抑制具有免疫調節功能的淋巴因子的產生，抑制T細胞和B細胞增殖，降低機體對腫瘤細胞的局部免疫反應；(3)COX-2過度表達可增加PGE2的合成，PGE2誘導細胞增殖并刺激Bcl-2蛋白表達，降低介導凋亡的轉化生長因子-β(TGF-β)2型受體水平，降低介導細胞間粘附的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)活性，從而抵抗各種刺激誘導的細胞凋亡，促進細胞增殖，引起腫瘤的發生；(4)COX-2促進PG合成的增加如PGE₁、PGE₂和15d-PGJ等作用于EP₂、EP₄及PPARr等，通過EP/cAMP等途徑激活各種胞內激酶如PKA、Ras蛋白活性，誘導VEGFmRNA和蛋白表達水平上調，參與腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤的轉移；(5)COX-2可使細胞周期存在明顯G₁期推遲，而且Cyclin?D₁蛋白激酶、Rb₁激酶和細胞周期依賴激酶(CDK4)活性明顯下降，這樣通過阻礙細胞周期，阻止延長細胞生存期，增強對胞外基質的粘附，而異常延長細胞生存期使一系列基因突變，促進腫瘤形成。另外，COX-2可促進腫瘤細胞相關血管的生成，增加癌細胞的侵襲性，激活基質金居蛋白酶2降解細胞外基質，產生促血小板凝集的血栓烷等，從而有利于腫瘤的侵襲和轉移。

COX-2在腫瘤發生、發展和轉移的整個過程中起著重要的作用，參與了腫瘤形成的多個環節。因此，對腫瘤組織或腫瘤細胞中COX-2活性檢測可以作為監測腫瘤的發生發展的一個重要手段，同時COX-2在細胞中的基因表達水平也可以作為抗腫瘤藥物篩選的一個重要指標。