[發明專利]一種用于轉基因玉米檢測的標準分子對照物及其制備方法

無效

• 申請號: 200910245031.2
• 申請日: 2009-12-23
• 公開（公告）號: CN101724702A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 蘭青闊;王永;朱珠;趙新;程奕
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院中心實驗室
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及轉基因作物檢測中必須的對照物質標準分子 及其制備方法，具體說是一種制備轉基因玉米中外源基因特異性片段標準分子對照物的 方法。

背景材料

轉基因產品越來越進入人們的生活。2006年全世界轉基因作物種植面積為10200 萬公頃，與2005年轉基因作物9000萬公頃相比增長了13％，從1996年到2006年十年 間轉基因作物總的種植面積增加了60倍。目前，世界各國已進行田間試驗的轉基因作 物超過5000種，批準商品化的轉基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、 馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等。 我國轉基因生物研究始于20世紀80年代初期，主要是轉基因抗蟲棉。近年來，政府不 斷加大對生物技術研究的支持力度，積極促進農業生物技術的研究與產業化開發。

轉基因作物安全性主要集中在轉基因作物釋放的環境安全性和由轉基因作物生產 出的食品的安全性上。包括對人和動物健康的風險、對生態環境與農業的風險、對非目 標生物的風險。針對第一種風險，1993年，聯合國經濟發展與合作組織(OECO)提出 了食品安全性評估的“實質等同性”原則。如果轉基因作物生產的產品與傳統產品具有 實質等同性，則可以認為是安全的。

最早提出對轉基因食品進行標識管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一 個法案，要求對轉基因產品進行標簽說明；1999年，要求出口到歐盟的非轉基因產品 不得含有1％的轉基因產品污染；2002年，歐盟將標識的最低限量降低到0.9％。日本、 澳大利亞、新西蘭對轉基因成分的最低含量做了不同規定，域值從1-5％不等。

我國于2001年5月9日公布并實施《農業轉基因生物安全管理條例》，于2002 年1月5日公布了農業轉基因生物安全評價、標識和進口安全管理三個配套管理辦法， 確定了第一批實施標識管理的農業轉基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。

轉基因作物檢測方法主要基于核酸水平的PCR檢測和基于蛋白質水平的檢測。核酸 水平檢測分為定性和定量檢測，蛋白質水平檢測包括酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫 試紙條法等。目前最常用的檢測方法是定性PCR檢測。通過對樣品中可能含有的外源基 因進行擴增，再利用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。如果電泳結果含有特異條帶，說明樣品 中含有轉基因成分；反之則沒有。

在進行定性PCR檢測時，應設置陰性對照、陽性對照和空白對照，以確保檢測過程 的有效性和檢測結果的可靠性。陰性對照是指用非轉基因作物中提取的DNA作為PCR 反應體系的模板；陽性對照是指用特定的轉基因作物中提取的DNA作為PCR反應體系的 模板；空白對照指用無菌重蒸水作為PCR反應體系的模板。由于轉基因作物存在生物安 全性的問題，所以有些轉基因作物的陽性樣品是很難得到的。為了滿足檢驗檢疫工作需 要，歐盟委員會直屬的聯合研究中心(JRC)下屬的兩個研究所——健康及消費者保護 研究所(IHCP)和標準物質及計量研究所(IRMM)在聯合研制轉基因產品檢測標準物質， 目前只制備出幾種轉基因作物標準樣品，包括轉基因大豆Round?Ready?Soybean、轉基 因玉米bt11，bt176，mon810，event?1507、轉基因棉花event?281-24-236x?3006-210-23 和轉基因甜菜event?H7-1，含量分別為0％、0.1％、0.5％、1％、2％和5％。而全世界已 有近百種商品化轉基因品種，現有的標準物質與快速增長的轉基因作物相比，根本無法 滿足檢測的需要。綜上所述，種類少、不易獲得是轉基因陽性材料存在的重要問題，嚴 重影響著轉基因檢測工作的進行。

由于各種限制，國內的檢驗檢疫機構很難獲得陽性樣品，而且國際上有證標準物質 的價格也一直居高不下，這些都成為了實際檢側工作中很重要的制約因素。為了解決這 個問題，國內各科研單位也做了大量研究工作，但是都不能避開轉基因生物的基因漂移 的問題。目前，以質粒作為陽性對照在國際轉基因檢測中的得到公認。例如在英國FAPAS 分析實驗室能力驗證測試中心組織的國際能力驗證(轉基因檢測)中，網站的提交信息 選項中明確表示質粒可以作為陽性材料使用。在國際期刊上發表的文章中，很多陽性對 照也使用質粒。

發明內容