[發明專利]一種用于轉基因玉米檢測的標準分子對照物及其制備方法

無效

• 申請號: 200910245031.2
• 申請日: 2009-12-23
• 公開（公告）號: CN101724702A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 蘭青闊;王永;朱珠;趙新;程奕
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院中心實驗室
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種用于轉基因玉米檢測的標準分子對照物，包括轉基因品系MON810、MON863、 BT11、BT176轉化事件特異性序列及內源基因zSSIIb特異片段，其先后順序為 zSSIIb+MON810+MON863+BT11+BT176；其中所述zSSIIb引物序列為Mai?Zss-o1? CGGTGGATGCTAAGGCTGATG、Mai?Zss-o2?CACACTTGAAAGGGCCAGG；所述Mon810引物序列為 Mai?810-o3?GCCCTTTCAAGTGTGCCCA、Mai810-o4?TGAGTGCGCAAGCAAATTCGG；所述Mon863 引物序列為Mai?863-o5?TTGCTTGCGCACTCAAAGACC、Mai?863-o6?GGTTCCGCTACCATCTTTGGG； 所述BT11引物序列為Mai?11-o7?AAAGATGGTAGCGGAACCCC、Mai?11-o8 CGTGCTTTGCAAGAAATGGTC；所述BT176引物序列為Mai?176-o9?CCATTTCTTGTGAAGCACGGTC、 Mai?176-o10?TCGACTTTATAGGAAGGGAGAGG。

2.一種用于制備權利要求1所述轉基因玉米標準分子對照物的PCR反應方法，其 特征在于：

第一輪反應：以非轉基因玉米及轉基因玉米品系MON810、MON863、BT11、BT176 基因組DNA為模板，分別用Zss-o1、Zss-o2，810-o3、810-o4，863-o5、863-o6，11-o7、 11-o8，176-o9、176-o10引物序列擴增；反應體系為：總體積為50μL，其中2倍pfU? mix緩沖液25μL，10mM上下游引物各0.5μL，50ng/μL模板1μL，用ddH₂O補足至 50μL；反應程序為：95℃，3min；30個循環，94℃，30sec；60-55℃，30sec；72℃， 1min；72℃，5min；4℃短期保存；產物記為PP_zssIIb-1、PP_M810-1、PP_M863-1、PP_B11-1、 PP_B176-1；

第二輪反應：以第一輪PCR擴增產物PP_zssIIb-1、PP_M810-1、PP_M863-1、PP_B11-1、PP_B176-1為模板，以o1-o10中對應引物，進行PCR擴增；反應體系為：總體積為50μL，其中2 倍pfU?mix緩沖液25μL，10mM上下游引物各0.5μL，用ddH₂O補足至50μL；

反應程序為：95℃，3min；30個循環，94℃，30sec；60-55℃，30sec；72℃，1min； 72℃，5min；4℃短期保存；產物記為PP_zssIIb-2、PP_M810-2、PP_M863-2、PP_B11-2、PP_B176-2；

第三輪反應，分兩步進行擴增：

第一步：取第二輪反應產物各5μL，2倍pfU?mix緩沖液7.5μL，用ddH₂O補足至 25μL；其中PP_M810-2與PP_M863-2相連接，PP_B11-2與PP_B176-2相連接；

反應程序：95℃，3min；10個循環，94℃，30sec；68℃，30sec；72℃，1min； 72℃，5min；4℃短期保存；產物記為Mega_810+863和Mega₁₁₊₁₇₆；

第二步：分別以第一步反應產物Mega810+863和Mega11+176為模板，引物分別為 Mai?810-o3和Mai?863-o6各1μL，Mai?11-o7和Mai?176-o10各1μL；加2倍pfU?mix 緩沖液12.5μL，用ddH₂O補足至50μL；

反應程序：95℃，3min；20個循環，94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，1min； 72℃，5min；4℃短期保存；產物記為PP_M810+M863、PP_B11+B176； 第四輪反應，分兩步進行擴增：

第一步：取第三輪反應產物PP_M810+M863、PP_B11+B176各5μL，2倍pfU?mix緩沖液 7.5μL，用ddH₂O?補足至25μL；

反應程序：95℃，3min；10個循環，94℃，30sec；68℃，30sec；72℃，2min； 72℃，5min；4℃短期保存；產物記為Mega_{810+863+11+176}；

第二步：分別以第一步反應產物，引物為Mai?810-o3和Mai?176-o10各1μL；加 2倍pfU?mix緩沖液12.5μL，用ddH₂O補足至50μL；

反應程序：95℃，3min；20個循環，94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，2min； 72℃，5min；4℃短期保存，產物記為PP_{M810+M863+B11+B176}； 第五輪反應，分兩步進行擴增：

第一步：取第二輪反應產物PP_zssIIb-2及第四輪產物PP_{M810+M863+B11+B176}各5μL，2 倍pfU?mix緩沖液7.5μL，用ddH₂O補足至25μL；

反應程序：95℃，3min；10個循環，94℃，30sec；68℃，30sec；72℃，2min； 72℃，5min；4℃短期保存；產物記為Mega_{zssIIb+810+863+11+176}；

第二步：以第一步反應產物為模板，引物為Mai?Zss-o1和Mai?176-o10各1μL； 加2倍pfU?mix緩沖液12.5μL，用ddH₂O補足至50μL；

反應程序：95℃，3min；20個循環，94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，2min； 72℃，5min；4℃短期保存；產物記為PP_{zssIIb+M810+M863+B11+B176}；

第六輪反應：以第五輪產物為模板1μL，用引物Mai?Zss-o1和Mai?176-o10擴增； 反應體系為：總體積為50μL，其中2倍Taq?mix緩沖液25μL，10mM上下游引物各1 μL，用ddH₂O補足至50μL；

反應程序為：95℃，3min；30個循環，94℃，30sec；60-55℃，30sec；72℃，1min； 72℃，5min；4℃短期保存；產物記為TP_{zssIIb+M810+M863+B11+B176}；回收純化第六輪產物， 連接于T-easy載體，導入大腸桿菌JM109即可長期保存使用。