[發(fā)明專利]具有抑制血小板凋亡活性的一種穿膜糖蛋白寡肽或其修飾物/衍生物及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910244346.5
• 申請日: 2009-12-29
• 公開（公告）號: CN101747413A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴克勝;李素萍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京航空航天大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K19/00;A61K38/08;A61P7/00;A61P7/02;A61P9/10
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的合成的可穿膜寡肽，其氨基酸序列及其抑制GPIb-IX與VWF結(jié)合誘導(dǎo)的血小板凋亡的能力。

本發(fā)明屬于分子生物學和血液病學范疇。

背景技術(shù)

細胞凋亡是生命的基本特征之一，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，由基因控制的細胞自主性死亡過程。細胞正常的凋亡功能是維持機體正常生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的前提，凋亡失衡可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。

血小板是參與血栓、特別是動脈血栓形成的主要有形成份。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，血小板同樣表達死亡受體、半胱氨酸蛋白酶caspases及Bcl-2蛋白家族等凋亡調(diào)控蛋白，可發(fā)生凋亡。機體內(nèi)血小板凋亡可能引起皮膚、黏膜、內(nèi)臟出血為特點的疾病。血栓性血小板減少性紫癜(TTP)是一種少見的微血管血栓-出血綜合癥，該病起病急驟，常于短期內(nèi)死亡，至今仍是一種潛在致死性疾病。TTP的主要病理特征為血小板減少、貧血，可引起腦部等廣泛性繼發(fā)出血。TTP的發(fā)病機制目前認為是患者有廣泛的微血管內(nèi)皮細胞損傷導(dǎo)致釋放大量異常的超大分子量血管性血友病因子(uLVWF)多聚體，與VWF多聚體相比，uLVWF與血小板表面的VWF膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)Ib-IX受體具有更高的親和性，在血流剪切力的作用下uLVWF與GPIb-IX的結(jié)合介導(dǎo)血小板的粘附與聚集，促進循環(huán)中的血小板形成微血栓，導(dǎo)致大量血小板消耗性減少。研究顯示，病理情況下，血小板GPIb-IX復(fù)合物與VWF的結(jié)合使得血小板以滾動方式粘附在損傷的血管內(nèi)皮表面，與此同時，啟動血小板細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，導(dǎo)致血小板內(nèi)發(fā)生Ca⁺⁺濃度增加，蛋白質(zhì)磷酸化，PI3K、PKC活化，ADP釋放等一系列反應(yīng)，從而誘導(dǎo)血小板表面另一受體GPIIb/IIIa(integrin?alpha?IIb?beta3)的活化，活化的GPIIb/IIIa與血漿中纖維蛋白原結(jié)合，最終導(dǎo)致血小板相互聚集成團，形成血小板血栓，因此，血小板表面GPIb-IX與VWF的結(jié)合是血小板參與血栓形成、止血的起始關(guān)鍵步驟。我們的最新研究表明，GPIb-IX受體與VWF的結(jié)合不僅可以誘導(dǎo)血小板的活化和聚集反應(yīng)，同時可以啟動血小板胞內(nèi)凋亡信號，誘導(dǎo)血小板凋亡的發(fā)生，此過程中細胞內(nèi)信號分子14-3-3蛋白與GPIbaC胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合起著關(guān)健作用。

血小板表面凋亡標志物磷脂酸絲氨酸(PS)的表達是內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)識別并清除循環(huán)中凋亡血小板的標志，因此，除了血小板血栓形成以外，GPIb-IX與VWF結(jié)合誘導(dǎo)的血小板凋亡

可能是導(dǎo)致TTP患者體內(nèi)血小板減少的另一主要機制。有效抑制血小板的減少，是治療TTP疾病的一個基本思路和有效途徑。目前國內(nèi)外臨床上常用血漿置換、抗血小板藥物等抑制血小板活化的方法治療TTP疾病，基于我們已有的研究基礎(chǔ)，以抑制GPIba與VWF結(jié)合誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生為靶標，創(chuàng)制一種可抑制血小板的始動凋亡途徑，從而抑制血小板減少或活性喪失的新型抗血小板凋亡藥物，必將會對TTP疾病的治療產(chǎn)生意想不到的效果，同時亦可有望提高醫(yī)用血小板體外儲存期。在GPIb的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，已知有3個14-3-3蛋白結(jié)合位點，分別為GPIba?609位點，GPIba?587-590位點和GPIbβ166位點，這些位點都是以磷酸化Ser為中心的結(jié)構(gòu)域。其中GPIba?609位點的存在是14-3-3蛋白與GPIb穩(wěn)定結(jié)合的前提。本發(fā)明在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，本室研究創(chuàng)建了新的可穿膜寡肽。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的：合成新的可穿膜寡肽，對其抑制血小板凋亡的功能進行研究驗證，最終創(chuàng)制一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)，可有效抑制血小板凋亡，對TTP等血小板減少疾病的治療以及提高醫(yī)用血小板體外儲存期具有潛在應(yīng)用價值的新型藥物。

技術(shù)方案：本發(fā)明分別應(yīng)用瑞斯托霉素和高剪切力誘導(dǎo)血小板GPIb-IX受體和VWF的結(jié)合，流式細胞術(shù)和Western-blot技術(shù)檢測血小板與VWF的結(jié)合情況及血小板凋亡指標；瑞斯托霉素分別誘導(dǎo)VWF與表達GPIba野生型(1b9)、GPIba-551(不含GPIba-551氨基酸以后的C-末端序列，Δ551)和GPIba-609A(GPIba?609位點Ser突變?yōu)锳la，S609A)三種細胞株結(jié)合，檢測各細胞株的凋亡指標；基于GPIba胞質(zhì)C-末端氨基酸序列(GPIba?605-610位點)設(shè)計合成新的GPIba?609Ser磷酸化可穿膜寡肽，瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板GPIb-IX和VWF的結(jié)合實驗對可穿膜寡肽功能進行研究。結(jié)果表明可穿膜寡肽可有效抑制GPIb-IX與VWF結(jié)合誘導(dǎo)的血小板凋亡。