[發明專利]一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒

無效

• 申請號: 200910243330.2
• 申請日: 2009-12-21
• 公開（公告）號: CN101724713A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 黃新;朱水芳;韓雪清;王慧煜;侯立華
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒。

背景技術

PCR(Polymerase?Chain?Reaction，聚合酶鏈式反應)技術是一種20世紀八十年代處發展起來的分子生物學技術，用于富集特定的DNA片段。它運用從溫泉細菌中分離出的DNA聚合酶(DNA?Polymerase)，通過變性、復性(退火)和延伸等三步反應，模擬體內DNA復制。能夠將極微量的核酸在短時間內迅速擴增復制，獲得大量的目的DNA片段。

PCR擴增完成后需要通過鑒定，才能確定是否真正準確可靠獲得了預期擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳是實驗室最常用的，簡便易行。核酸分子帶負電，在電場下向正極運動，不同分子大小的核酸帶電量不同，在凝膠介質的分子篩作用下，使分子大小不同的核酸分子出現不同的遷移率，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入染料，在凝膠分析系統中進行分析。

瓊脂糖凝膠電泳的濃度通常在0.5-2％之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來分離小片段的電泳。比如實驗室常用的1％的瓊脂糖凝膠電泳可以分辨的核酸大小為0.5kb-7kb，2％的膠可以分辨0.1kb-3kb的核酸。由此可見，其分辨率不高，當核酸片段大小相近(或相同時)就無法區分，在電泳中這幾條分子大小相近的條帶就可能只顯現出一條帶。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒。

本發明提供的檢測待測生物樣本中是否含有DNA片段甲和/或DNA片段乙的雙色熒光多重PCR(DFM-PCR，Dual?Fluorescence?Multiplex-PCR)方法，包括如下步驟：將待測生物樣本的總DNA作為模板，用引物對甲和引物對乙進行多重PCR；將多重PCR的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段乙，如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段甲；引物對甲的5’端用Tamra標記，引物對乙的5’端用Cy5標記；所述引物對甲用于擴增DNA片段甲；所述引物對乙用于擴增DNA片段乙。

所述瓊脂糖凝膠電泳具體可為0.5-2％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，如0.5-1％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1-1.5％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1.5-2％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳等。當所述瓊脂糖凝膠電泳為1％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳時，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差7000bp以下，具體可相差500bp以下。當所述瓊脂糖凝膠電泳為2％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳時，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙相差3000bp以下，具體可相差100bp以下。本發明的方法的靈敏度遠遠高于常規DNA檢測所用的的瓊脂糖凝膠電泳-SYBGreenI染色法。

所述雙色熒光多重PCR方法可應用于檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒。

本發明還保護一種檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟：將待測生物樣本的cDNA為模板，用引物對A和引物對B進行多重PCR，將多重PCR的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；所述引物對A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra(TAMRA)標記；所述引物對B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5標記。所述瓊脂糖凝膠電泳具體可為0.5-2％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳，如0.5-1％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1-1.5％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳、1.5-2％(質量百分含量)瓊脂糖凝膠電泳等，具體可為2％瓊脂糖凝膠電泳。

所述多重PCR的反應條件具體可為：95℃、5min；94℃、30s，52℃、60s，72℃、90s，35個循環；72℃、10min。所述多重PCR的反應體系中，反應初始時，每個所述引物對的上游引物和下游引物的濃度具體均可為0.1mmol/L。